两种药物残留—溴布特罗和双氯芬酸钠酶联免疫吸附分析法的建立

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近年来,食品和环境中的残留药物对人类健康的危害事件层出不穷,人们对药物残留的关注与担忧日益增强。溴布特罗和双氯芬酸钠是两种性质和用法都不同的药物。溴布特罗是近几年来出现的一种瘦肉精,顾名思义,其具有促进动物的肌肉生长及提高饲料转化率的作用。但肉制品中的瘦肉精残留会对人类的身体健康产生潜在的危害。在中国,溴布特罗已被列于在动物饲料和饮用水中禁止使用的药物名单中。而双氯芬酸钠是种非甾体抗炎药,具有很强的解热镇痛作用,常用于人类以及畜牧业中各种动物的疾病治疗和预防,而双氯芬酸钠及其代谢物会通过各种方式排放到水环境中,在世界范围内常在水体中被检测到。在印度次大陆,据文献报道,由于秃鹫食用了含有双氯芬酸钠残留的动物组织和内脏,使得秃鹫种群数目锐减,几乎引发了一场生态圈的灾难。在国内外,测定这两种残留药物的方法有限,为了对环境中的药物残留问题加以防范,建立溴布特罗和双氯芬酸钠的快速检测方法是十分必要的。本实验分别成功制备出了高灵敏度,高特异性的溴布特罗单克隆抗体和双氯芬酸钠单克隆抗体和多克隆抗体,并以此为基础建立了溴布特罗和双氯芬酸钠的高灵敏度、高特异性的酶联免疫吸附分析法(ELISA)。其中溴布特罗包被原和免疫原用重氮化法合成,双氯芬酸钠包被原和免疫原用活化酯法合成。对于溴布特罗,我们成功筛选出了两支能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株(13D12C1,4D11C1),并将其保存。在最优实验条件下,以13D12C1分泌的抗体建立的ELISA的IC50和检测限(LOD)分别为0.56 ng mL-1和0.047 ng mL-1。表明建立的ELISA具有高灵敏度。此ELISA除了与克伦特罗有52.8%的交叉反应外,与其他结构类似的β-激动剂如莱克多巴胺,沙丁胺醇以及其他8种药物都没有交叉反应。表明此ELISA具有较高的特异性。为了考察ELISA的准确性和精密度,本实验的加标实验采用了三种样品:猪饲料、猪肉和猪肝,批内和批间的回收率和变异系数(CV)分别为87.3-107.5%和3.5-11.6%(n=3),85.7-116.0%和4.1-12.7%(n=3)。而且建立的ELISA与HPLC的测定结果有着良好的相关性。对于双氯芬酸钠,我们基于单抗和多抗分别建立了检测双氯芬酸钠的ELISAs。在最优实验条件下,各自的IC50和LOD分别为0.06 ng mL-1和0.01ng mL-1,0.13 ng mL-1和7.88pg mL-1。这两种ELISAs与其他11种化合物如抗炎药和结构类似的化合物都没有交叉反应。实验中用水样做了加标实验并与LC-MS/MS做了对照。其中基于单抗的ELISA的批内和批间的回收率和CV分别为74.0-114.0%和4.1-15.0%(n=3),83.5-121.1%和6.7-13.8%(n=3)。基于多抗的ELISA的批内和批间的回收率和CV分别为84.0-115.2%和2.4-12.0%(n=3),82.9-117.8%和5.3-18.2%(n=3)。与LC-MS/MS的测定结果相比,这两种ELISAs均与LC-MS/MS有着良好的相关性(单抗R=0.9903;多抗R=0.9864)。以上结果表明基于双氯芬酸钠单/多抗的ELISA具有高灵敏度,高特异性,而且有着较好的准确性和精密度。综上可知,本研究基于溴布特罗单抗、双氯芬酸钠单抗和双氯芬酸钠多抗三种抗体建立的三种ELISAs都具有高的灵敏度和高的特异性,而且还具有ELISA的传统优势如操作简便、成本低,并在实际样品的快速检测也具有良好的表现,为快速检测溴布特罗和双氯芬酸钠提供了一种可行的检测方法。
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