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目的:子痫前期是妇产科常见疾病并发症,目前对子痫前期患者采用了解痉、降压、镇静、利尿等保守治疗方法,虽能暂时缓解症状,但目前最有效的治疗方法仍是适时终止妊娠,产妇面对心脑肾等严重并发症的同时,也因此常导致早产及早产相关的围生儿患病率和病死率增加。在子痫前期疾病的病因机制研究中,滋养细胞浸润能力减弱并因此而造成的受精卵着床过浅及后续异常的子宫螺旋小动脉重铸最为普遍认可接受,对子痫前期患者改善妊娠早期“浅着床”,即改善子宫螺旋小动脉的重铸,从而终止其后的内皮细胞损伤等病理生理过程非常关键。LIN28是1997年发现的一种RNA结合蛋白,伴随RNA的调控代谢过程,高度保守。近年来发现在胚胎干细胞分化中可检测到LIN28B的表达和积极参与,在肿瘤细胞中也发现LIN28B参与细胞增殖及迁移等。课题组前期研究检测的结果提示LIN28B在人类胎盘组织中有表达,且子痫前期LIN28B的表达可能存在时序性差异,并与滋养细胞浸润有关。核斑点旁组装转录1（nuclear paraspeckle assembly transcript1,NEAT1）是近年来发现的一种lnc RNA,在肿瘤的发生发展中有着重要作用。主要表现为参与肿瘤细胞的增殖、侵袭及转移等,在肿瘤细胞周期及凋亡中也有一定作用。在一些实体肿瘤中NEAT1有着致癌基因的作用;在一些非实体肿瘤中NEAT1有着抑癌基因的作用,这种表达失调可能是其在肿瘤诊断及预后的潜在生物学分子。NEAT1在绒毛组织中有表达,并且在复发性流产中表达下调;NEAT1也表达于足月妊娠胎盘绒毛滋养细胞中,其在胎儿生长受限患者胎盘中表达明显高于正常对照组（4倍升高）;NEAT1在子痫前期研究报道较少。多功能蛋白聚糖（versican,VCAN）是一种硫酸软骨素蛋白聚糖,可促进肿瘤细胞增殖和凋亡,也有抑制肿瘤的作用。子痫前期疾病有特征性基因谱,VCAN可作为基因谱网络的中枢基因之一影响子痫前期发病机制,在脐动静脉壁中,VCAN表达上调,但血液及胎盘中VCAN表达未见相关报道。本研究拟通过人胎盘组织及体外细胞实验,探讨子痫前期中LIN28B靶向调控NEAT1/miR-181d-5p/VCAN轴的相关作用机制。方法:1.选取2018年01月到2022年5月在中国医科大学附属盛京医院滑翔院区产科住院分娩的58例孕产妇作为研究对象（早发型子痫前期组15例,早发对照组13例,晚发型子痫前期组15例,晚发对照组15例）,无菌操作收集胎盘组织。采用实时荧光定量q RT-PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction）法及免疫印迹（Western Blot）法检测胎盘组织中LIN28B表达。在滋养细胞株HTR-8/SVneo中敲减LIN28B,检测敲减表达效率并进行生物学功能验证。QRT-PCR检测滋养细胞株HTR-8/SVneo中LIN28B敲减后NEAT1表达变化。RIP检测LIN28B是否与NEAT1存在靶向结合。在同样胎盘组织中q RT-PCR检测NEAT1表达。2.在滋养细胞株HTR-8/SVneo中敲减NEAT1,检测敲减效率,并利用transwell实验及划痕实验探究敲减NEAT1对滋养细胞株HTR-8/SVneo生物学行为的影响。LIN28B-SI3和NEAT1-SI3共转染滋养细胞中,再次检测细胞侵袭和迁移能力的变化,验证NEAT1-SI3是否可以回复LIN28B-SI3对滋养细胞株HTR-8/SVneo生物学行为的影响。3.通过在滋养细胞中敲减LIN28B的miRNA表达谱芯片筛查,选择其中差异明显且预测靶基因大于3个生物学网站的3个miRNAs,利用q RT-PCR技术在扩大的组织样本中进行了验证。在胎盘组织中q RT-PCR检测miR-181d-5p表达,在滋养细胞株HTR-8/SVneo中过表达或敲减miR-181d-5p,检测过表达或敲减效率,并利用transwell实验及划痕实验探究过表达或敲减miR-181d-5p对滋养细胞株HTR-8/SVneo生物学行为的影响。LIN28B-SI3和miR-181d-5p minics共转染滋养细胞中,再次检测细胞侵袭和迁移能力的变化,验证miR-181d-5p minics是否可以回复LIN28B-SI3对滋养细胞株HTR-8/SVneo生物学行为的影响。4.生物信息学数据库预测NEAT1通过“竞争性内源性RNA（competing endogenous RNA,ce RNA）”机制,靶向调控miR-181d-5p/VCAN,双荧光素酶实验验证NEAT1是否与miR-181d-5p存在靶向结合,miR-181d-5p是否与VCAN存在靶向结合。在滋养细胞株HTR-8/SVneo中q RT-PCR及WB检测NEAT1/miR-181d-5p对VCAN表达的影响。在胎盘组织中q RT-PCR及WB检测VCAN表达,在滋养细胞株HTR-8/SVneo中敲减VCAN,检测敲减效率,并利用transwell实验及划痕实验探究敲减VCAN对滋养细胞株HTR-8/SVneo生物学行为的影响。将NEAT1-SI3和miR-181d-5p inhibitor,miR-181d-5p inhibitor和VCAN-SI1分别共转染至滋养细胞株HTR-8/SVneo细胞中,观察对细胞侵袭和迁移的影响,验证miR-181d-5p inhibitor是否可以回复NEAT1-SI3,VCAN-SI1是否可以回复miR-181d-5p inhibitor对滋养细胞株HTR-8/SVneo生物学行为的影响。QRT-PCR及WB检测LIN28B对VCAN表达的影响。结果:1.在早发型和晚发型子痫前期胎盘组织中采用q RT-PCR及WB检测发现LIN28B表达明显低于相应的对照组。将敲减LIN28B序列转染到滋养细胞株HTR-8/SVneo中,q RT-PCR及WB实验表明敲减效果明显（P＜0.05）。敲减LIN28B抑制滋养细胞株HTR-8/SVneo的侵袭及迁移能力。QRT-PCR实验发现敲减LIN28B后NEAT1表达增加;通过RIP实验,证实LIN28B与NEATI靶向互作。QRT-PCR检测子痫前期胎盘组织中NEAT1比同孕周正常孕妇表达明显增高。2.将NEAT1敲减序列转染到滋养细胞株HTR-8/SVneo中,q RT-PCR验证NEAT1敲减效果明显。敲减NEAT1增加滋养细胞株HTR-8/SVneo的侵袭及迁移能力。NEAT1-SI3可逆转LIN28B-SI3对滋养细胞侵袭及迁移能力,NEAT1可能在子痫前期滋养细胞发病过程中起重要的调控作用。3.通过滋养细胞中敲减LIN28B后的miRNA芯片表达谱,发现了29个下调（∣log2FC∣≥1,P＜0.05）,2个上调的miRNAs,同时对差异表达的1个上调和9个下调的miRNA进行靶基因预测,选取数据库预测靶基因≧3次的3个下调的miRNA,在临床扩大的组织样本中采用q RT-PCR进行验证,证明基因芯片结果的可靠性。QRT-PCR证明子痫前期胎盘组织中miR-181d-5p比同孕周正常孕妇表达明显降低（P＜0.05）。将过表达或敲减miR-181d-5p序列转染到滋养细胞株HTR-8/SVneo中,q RT-PCR验证miR-181d-5p过表达或敲减效果明显。滋养细胞株HTR-8/SVneo中transwell及划痕实验证明过表达miR-181d-5p增加细胞的侵袭及迁移能力,反之抑制细胞的侵袭及迁移能力。LIN28B-SI3对滋养细胞侵袭及迁移能力可被miR-181d-5p minics逆转。4.生物信息学数据库预测NEAT1通过“ce RNA”机制,海绵化miR-181d-5p,靶向调控VCAN发挥作用。双荧光素酶实验验证NEAT1与miR-181d-5p,VCAN与miR-181d-5p存在靶向结合。滋养细胞滋养细胞株HTR-8/SVneo中敲减NEAT1后VCAN表达下降;过表达miR-181d-5p后,VCAN表达明显降低;沉默miR-181d-5p后,VCAN表达明显增加。QRT-PCR证明子痫前期胎盘组织中VCAN比同孕周正常孕妇表达明显增高（P＜0.05）,且VCAN早发型表达明显高于晚发型。将敲减VCAN序列转染到滋养细胞株HTR-8/SVneo中,q RT-PCR及WB验证VCAN敲减效果明显。滋养细胞株HTR-8/SVneo中transwell及划痕实验证明敲减VCAN增加细胞的侵袭及迁移能力。Mi R-181d-5p inhibitor可逆转NEAT1-SI3对滋养细胞的侵袭及迁移能力,敲减VCAN可逆转miR-181d-5p inhibitor对滋养细胞的侵袭及迁移能力。滋养细胞株HTR-8/SVneo中,q RT-PCR及WB实验证明敲减LIN28B后VCAN表达增加。结论:1.LIN28B在正常及子痫前期孕妇胎盘组织中有表达。子痫前期胎盘组织中,LIN28B表达明显低于同孕周正常孕妇。NEAT1在正常及子痫前期孕妇胎盘组织中有表达,子痫前期胎盘组织中NEAT1表达明显高于同孕周正常孕妇。滋养细胞株HTR-8/SVneo中,敲减LIN28B可抑制滋养细胞的侵袭和迁移。LIN28B可以负向调控NEAT1表达,且有靶向互作。LIN28B可能通过调控NEAT1参与子痫前期发病。2.滋养细胞株HTR-8/SVneo中,敲减NEAT1可促进滋养细胞的侵袭和迁移。敲减NEAT1可以逆转敲减LIN28B对滋养细胞的侵袭及迁移能力。LIN28B通过调控NEAT1参与滋养细胞浸润。3.LIN28B基因芯片结果显示,多个miRNAs在敲减LIN28B的滋养细胞株HTR-8/SVneo中存在差异表达,且芯片预测结果在胎盘组织得到验证。Mi R-181d-5p在正常及子痫前期孕妇胎盘组织中有表达。子痫前期胎盘组织中miR-181d-5p表达明显低于同孕周正常孕妇。滋养细胞株HTR-8/SVneo中,过表达miR-181d-5p促进滋养细胞的侵袭和迁移,敲减miR-181d-5p抑制滋养细胞的侵袭和迁移。过表达miR-181d-5p可逆转敲减LIN28B对滋养细胞的侵袭及迁移能力。LIN28B通过调控miR-181d-5p参与滋养细胞浸润。4.生物信息学预测NEAT1/miR-181d-5p/VCAN轴存在“ce RNA”作用机制。实验验证NEAT1/miR-181d-5p/VCAN轴存在ce RNA互作机制,参与子痫前期发病。VCAN在正常及子痫前期孕妇胎盘组织中有表达。子痫前期胎盘组织中VCAN表达明显高于同孕周正常孕妇,且早发型子痫前期VCAN表达高于晚发型子痫前期。滋养细胞株HTR-8/SVneo中,敲减VCAN促进滋养细胞的侵袭和迁移。挽救实验可回复NEAT1/miR-181d-5p/VCAN轴的滋养细胞侵袭和迁移生物学功能。LIN28B表达变化影响下游VCAN表达,存在负向调控机制。滋养细胞HTR-8/SVneo中由LIN28B调控的NEAT1/miR-181d-5p/VCAN轴影响细胞的侵袭和迁移,参与子痫前期发病。