目的:艾滋病（Acquired Immune Deficiency Syndrome,AIDS）是由人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus,HIV）感染机体后造成的获得性免疫缺陷综合征,是损害人类健康和引起人类死亡的重大传染性疾病。临床上常用的高效抗逆转录病毒疗法（Highly Active Antiretroviral Therapy,HAART）虽然成功抑制了HIV的复制并控制了AIDS的进展,但其长期使用后引发的耐药性问题日益显著,因此寻找抑制HIV复制的新靶点和新作用机制是当前艾滋病治疗领域的重要任务。HIV作为一种专性细胞内寄生的微生物,其生命周期中大部分步骤依赖于宿主细胞,这些过程通常通过病毒和宿主蛋白的相互作用实现。例如HIV整合酶招募宿主辅助因子LEDGF以优化子代病毒的产生。然而,宿主细胞内一组独特的细胞因子也在进化,以抵抗病毒病原体（如HIV）的复制。这些所谓的限制因子通过干扰病毒生命周期的特定步骤,构成宿主细胞对病毒复制的物理或功能性防御。病毒限制因子一般具有以下特点:1、结构和功能的多样性;2、发挥抗病毒功能的机制的多样性;3、多为宿主固有蛋白;4、多数由干扰素诱导产生,使其在病毒感染早期发挥作用。因此,除了经典的细胞和体液以及信号介导的固有免疫外,限制因子也被视为宿主的固有免疫反应。截至目前已发现的HIV-1的限制因子主要有:MX2、SAMHD1、APOBEC3G、TRIM5α、BST-2和MARCH8/2等。这些宿主限制因子与病毒组分之间进行相互作用,同时也能够诱导机体产生特异性免疫应答,对于开发新的艾滋病治疗方法至关重要。TRAB结构域包含蛋白2B（TRAB Domain-Containing Protein 2B,TRABD2B）是一种金属蛋白酶,与TRABD2A同属于金属蛋白酶家族。研究发现,TRABD2B和TRABD2A的主要生理功能为通过负向调节Wnt信号通路促进斑马鱼胚胎的脑部发育。使用TRABD的蛋白序列通过Neighbor-Joining法进行系统发育分析,发现TRABD蛋白在脊椎动物物种中高度保守且其功能均与胚胎的脑部发育密切相关,这可能是物种进化过程中正向选择（positive selection）的结果,即因含有有利突变而提高个体适合度的等位基因固定下来的选择作用。最新的研究发现,TRABD2A在人静息CD4+T细胞中发挥抑制HIV-1复制的作用。根据系统发育分析结果,我们推测人及其他脊椎动物的TRABD2B可能也具有抗病毒功能。本研究旨在探讨TRABD2B在HIV复制中的作用及机制,并探讨不同种属脊椎动物的TRABD2B对HIV复制的影响是否具有保守性（正向选择）,为抗病毒治疗新靶点的开发提供实验依据。方法:1.研究对象1.1本研究受试者均来自于中国医科大学附属第一医院,共招募健康献血者3例,年龄为23-30岁,男性1名,女性2名,每例采集全血100mL。入选标准:身体状况良好,近一个月来无细菌或病毒性感染,无肝肾疾病及其他代谢性疾病,无自身免疫病,女性排除妊娠,且本研究已获得中国医科大学附属第一医院医学科学研究伦理委员会审批。1.2研究TRABD2B抑制病毒复制及机制:采用人胚肾293T细胞系进行过表达实验。人宫颈癌细胞系TZM-bl稳定表达CD4、CXCR4和CCR5表面分子,并携带有荧光素酶和E.coliβ-半乳糖苷酶基因。作为报告细胞,TZM-bl细胞感染HIV后,荧光素酶基因被HIV长末端重复序列（LTR）和HIV辅助蛋白Tat转录激活,进而活化表达。人胚肾293T细胞系和人宫颈癌细胞系TZM-bl均采用含10%FBS和100U/mL青-链霉素的DMEM培养基培养。1.3研究内源性TRABD2B抑制病毒复制:主要应用人胚肾293T细胞系、人T淋巴细胞株（Jurkat T）、人原代CD4+T细胞、CD14+单核细胞（monocyte）、人单核细胞来源的巨噬细胞（MDM）和树突状细胞（MDDC）。2.实验方法2.1原代细胞的分离培养及诱导分化:聚蔗糖Ficoll分离健康人PBMCs,采用EasySep?Human CD14 Positive Selection Kit II和Human CD4⁺T Cell Enrichment Kit（Stemcell Technologie）分别分选CD14⁺单核细胞和CD4⁺T淋巴细胞。采用浓度为50U/mL的IL-2和25μL/10⁶个细胞的人T细胞激活剂Dynabeads CD3/CD28激活CD4⁺T细胞。采用50ng/m L的GM-CSF诱导培养CD14⁺单核细胞7-9d,即为单核细胞来源的巨噬细胞（Monocyte-Derived Macrophage,MDM）;采用含10ng/mL GM-CSF和50ng/mL IL-4的IMDM培养基培养5-7d,即为单核细胞来源的树突状细胞（Monocyte-Derived Dendritic Cells,MDDC）,单核细胞诱导过程中每2d更换新鲜培养液1次。2.2细胞系的培养:采用DMEM培养基培养人胚肾细胞系293T和人宫颈癌细胞系TZM-bl细胞,RPMI1640培养基培养人T淋巴细胞系Jurkat T细胞,所有培养基均含10%FBS和100U/mL青-链霉素,并将细胞置于37℃、含5%CO2的培养箱中培养,每2d更换新鲜培养液1次。2.3细胞转染:293T细胞质粒转染采用jet PRIME试剂,siRNA转染采用Lipofectamin 3000试剂,详细转染步骤以相应试剂说明书为准。2.4上清病毒载量检测:使用Roche COBAS AMPLICOR自动载量仪对上清病毒载量进行检测,检测方法为实时荧光定量聚合酶链反应（Real Time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）,检测范围为20-10,000,000 copies mL^-1。2.5胞内Total RNA的提取及RT-qPCR:细胞中Total RNA的提取采用TRIzol试剂,NanoDrop?One/OneC紫外-可见光分光光度计鉴定RNA样品的纯度并初步定量;采用PrimeScript^TMM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒去除样品中的DNA污染,进一步通过逆转录合成cDNA;采用TB GreenTM Premix Ex TaqTM II试剂盒通过实时定量PCR对目的基因表达水平进行检测。2.6免疫印迹分析:收集细胞至EP管,采用RIPA Lysis and Extraction Buffer（Thermo Fisher）重悬细胞,超声波辅助破碎细胞。离心取上清至新EP管中,加入4×Protein SDS PAGE Loading Buffer（Takara）后煮沸使蛋白变性;SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（凯基生物）制胶,80V电泳浓缩胶,120V电泳分离胶;冰上恒流0.3A（或恒压60V）转膜2h;PBST洗膜一次后采用2%BSA室温封闭1h;一抗室温孵育1h,PBST洗3次,每次5min;二抗室温孵育30min,PBST洗3次,每次5min;ECL发光液孵育1min后在凝胶成像分析仪上显影成像,以GAPDH蛋白为内参进行结果分析。2.7 HIV-1_NL4-3（VSV-G）包装及感染:HIV-1_NL4-3（VSV-G）包装采用293T细胞:采用jetPRIME转染试剂向5×10⁶个细胞中转染pCMV-VSV-G质粒和pNL4-3质粒各3.3μg和6.7μg,转染后4-6h更换新鲜培养基,48h后收集上清并用0.45μm滤器过滤。采用试剂盒（Advanced BioScience Laboratories,ABL）通过ELISA法检测HIV-1p24抗原。按照低剂量10 ng p24和高剂量100ng p24的病毒感染293T细胞。2.8荧光素酶表达水平检测:依照荧光素酶表达水平检测说明书（美国Promega公司）检测细胞中的荧光素酶表达水平。2.9 ELISA法检测HIV-1 p24抗原:收集细胞培养上清,采用HIV-1 p24 Antigen Capture Assay试剂盒（Advanced BioScience Laboratories,ABL）检测HIV-1 p24抗原。按试剂说明书稀释标准品,并稀释样品至适宜浓度。反应板中各孔均加入裂解液25μL,于每孔中加入已稀释的标准品、样品、阳性和阴性对照各100μL,封板,37℃孵育1h;用wash buffer进行洗板,重复5次,最后1次拍净孔内残余的液体;除空白孔外,所有孔中均加入酶标二抗100μL,封板,37℃孵育30min;用wash buffer进行洗板,重复5次,最后1次拍干孔内残余的液体;所有孔中加入显色液A和显色液B各50μL,封板,37℃孵育30min;所有孔中加入50μL终止液,设置酶标仪波长为450nm进行检测。3.统计分析所有实验重复3次,采用SPSS20.0和Graphpad Prism7.0软件进行统计学分析,计量资料采用x±s表示。两组间的比较采用独立样本t检验;多组实验进行比较时,采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。以P﹤0.05为差异具有统计学意义。结果:1.TRABD2B对HIV复制的影响在293T细胞中共转染TRABD2B-GFP/Mock表达质粒和HIV-1病毒质粒pNL4-3,48h后收集各组上清感染TZM-bl报告细胞,结果显示:TRABD2B组荧光素酶表达水平低于Mock组（P<0.05）,提示TRABD2B组HIV-1病毒颗粒产生减少或病毒侵染能力降低,即TRABD2B能够抑制HIV-1复制。同时检测TRABD2B对HIV-2及猴免疫缺陷病毒（Simian Immunodeficiency Virus,SIV）复制的影响,结果显示:TRABD2B能够抑制HIV-2和SIV的复制,提示TRABD2B具有广泛的抗病毒作用。2.TRABD2B抑制HIV-1复制的机制在293T细胞中共转染TRABD2B-GFP/Mock表达质粒和HIV-1病毒质粒pNL4-3,48h后收集上清和细胞,检测上清中病毒p24及RNA含量（即病毒载量）,同时检测细胞中HIV-1 Gag RNA（即病毒转录水平）含量。结果显示:TRABD2B组细胞培养上清中病毒p24及病毒载量均低于Mock组（所有P<0.05）,提示TRABD2B组HIV-1子代病毒颗粒产生减少。而TRABD2B组HIV-1 Gag RNA水平与Mock组相比无明显变化（P>0.05）,提示TRABD2B不影响HIV-1转录。HIV-1 Gag RNA表达不变,而其产物p24含量降低,且TRABD2B属于蛋白酶家族,提示TRABD2B可能通过降解病毒结构蛋白Gag抑制子代病毒颗粒产生进而抑制病毒的复制。为了进一步明确此设想,在293T细胞中共转染TRABD2B-GFP/Mock表达质粒和3Flag-Gag表达质粒,48h后收集细胞检测Gag蛋白含量,结果显示TRABD2B组Gag含量低于Mock组,提示TRABD2B能够降解Gag蛋白。Uniprot网站显示TRABD2B主要分布于细胞膜,而HIV-1 Gag蛋白也是靶向到细胞膜上进行组装,因此,TRABD2B可能降解细胞膜上而不降解细胞质中的Gag蛋白。为了验证此假设,我们构建了缺失MA的Gag表达质粒（3Flag-Gag-ΔMA,不能靶向到细胞膜）并与TRABD2B-GFP/Mock表达质粒共转染,48h后收集细胞检测Gag-ΔMA蛋白含量,结果显示TRABD2B组Gag-ΔMA含量与Mock组相比,无明显变化,说明TRABD2B不能作用于缺失MA的Gag蛋白质,因为MA是将Gag定向于细胞膜的“信号肽”,所以,TRABD2B只能作用于细胞膜上的Gag蛋白。以上结果提示:TRABD2B通过降解细胞膜上的Gag蛋白抑制HIV-1子代病毒颗粒的产生,进而抑制HIV-1的复制。3.内源性TRABD2B对HIV-1子代病毒产生的影响采用RT-qPCR法对多种细胞中TRABD2B mRNA的表达水平进行检测,结果显示:TRABD2B在静息及激活CD4+T细胞中均不表达,而在单核细胞来源的巨噬细胞（MDM）及树突状细胞（MDDC）和293T细胞中均有较低含量表达;使用siTRABD2B下调293T细胞中内源性TRABD2B的表达水平并感染高（100ng）或低剂量（10ng）的HIVNL4-3（VSVG）病毒,48h后收集上清感染TZM-bl报告细胞,结果显示:敲减TRABD2B后,当感染低剂量HIV时,si TRABD2B组荧光素酶表达水平高于对照组（siCtrl）,而感染高剂量HIV时,siTRABD2B组荧光素酶表达水平与siCtrl组无明显差别,提示在低感染剂量时内源性TRABD2B能够抑制HIV-1子代病毒的产生。4.不同种属TRABD2B对HIV-1子代病毒产生的影响在293T细胞中共转染不同种属TRABD2B/Mock表达质粒和HIV-1病毒质粒pNL4-3,48h后收集上清感染TZM-bl报告细胞,结果显示:不同种属TRABD2B组荧光素酶表达水平均低于Mock组,提示不同种属TRABD2B能够不同程度地抑制HIV-1子代病毒的产生,种属间TRABD2B的抗病毒功能较为保守。结论:TRABD2B通过降解靶向到细胞膜上的Gag蛋白,减少HIV-1子代病毒产生,抑制HIV-1复制,且不同种属TRABD2B的抗病毒功能具有保守性。