第一部分微血管侵犯对早期肝癌肝切除术切缘选择的影响研究目的:切缘对肝细胞癌(HCC)肝切除预后的影响仍有很大争议。微血管侵犯(MVI)是一个被广泛接受的HCC外科预后危险因子。目前还没有证据显示对于MVI阳性患者,增加切缘是否能改善预后。为了评价MVI对肝切除方式的影响,我们分别分析切缘对有,无MVI的乙肝相关早期肝癌患者预后的影响。研究方法:回顾性搜集2000年到2013年3263例连续性接受R0切除的单发乙肝相关HCC病人临床病理资料。肿瘤复发和患者总体生存率分别采用Kaplan-Meier法进行估计和Log-Rank检验比较。Cox等比例风险模型用来分析影响肿瘤复发和总体生存的独立危险因素。结果:对于单发的乙肝相关HCC,总体MVI发生率为37.2%(1213/3263)。在MVI阳性的病人中,宽切缘者(≥1cm,n=648)5年复发率和生存率分别是75.5%和44.0%,而窄切缘者(<1cm,n=565)分别为83.8%和28.5%,两者差异有统计学意义(复发:P<0.001;生存:P<0.001);但在MVI阴性的病人中,宽,窄切缘者预后没有差异(复发:P=0.359;生存:P=0.431)。同时,多因素Cox分析表明,对于MVI阳性的病人,窄切缘是肿瘤复发(HR,1.32;95%CI,1.16-1.51)和病人总体生存(HR,1.42;95%CI,1.21-1.67)的独立危险因素;宽切缘者早期复发发生率要显著低于窄切缘者(宽切缘:59.7%VS.窄切缘:68.7%,P=0.001)。在945例伴有肝硬化的MVI阳性病人中,宽切缘者术后并发症发生率显著高于窄切缘者(宽切缘:36.0%;窄切缘:26.5%,P=0.002),但两者死亡率并无统计学差异(宽切缘:1.5%;窄切缘:2.3%,P=0.367)。同样地,在这组病人中,窄切缘也是影响肿瘤复发(HR,1.26;95%CI,1.09-1.47)和总体生存(HR,1.51;95%CI,1.26-1.81)的独立危险因素。结论:对于MVI阳性的乙肝相关早期肝癌病人,选择宽切缘肝切除较窄切缘能显著延长其长期生存。对于同时伴有肝硬化的病人,选择宽切缘肝切除虽然术后并发症增多,但手术死亡率没有增加,而长期预后更好。第二部分早期肝细胞癌微血管侵犯的术前预测研究目的:MVI是影响早期肝癌预后的重要危险因素之一。MVI作为一个病理指标,很难在术前直接获得。MVI可影响早期肝癌外科治疗方式,肝切除的术式选择,术中辅助治疗。但目前在术前还不能可靠的预测MVI,其对临床决策的影响收到很大限制。对此,我们基于术前临床资料,探索构建能准确预测MVI的列线图模型(nomogram)。(一)研究方法:前瞻性收集东方肝胆外科医院连续的乙肝相关肝癌病人临床病理资料。其中,1004例影像学符合米兰标准(Milan criteria)的患者纳入研究。他们于2004年4月6日到2011年2月22日接受根治性肝切除术,并术后病理证实为HCC。其中,2004年4月到2008年10月的707例病人作为训练组来构建预测MVI的列线图模型,2008年10月至2011年2月的297例病人作为验证组来验证模型的表现。数据分析在2014年11月11日进行。病理发现MVI是本研究的主要终点,总体生存和至复发时间是次要终点。Kaplan-Meier法用来估计1,3,5年总体生存率和复发率,Log-Rank检验比较生存分布之间的差异。多因素Logistic回归确定影响MVI发生的独立危险因素。这些独立影响因子随后被用来建立列线图模型。模型预测的准确性和一致性分别用Harell C指数和一致性曲线图来评估。列线图评分的最佳截断值,及其对应的敏感度,特异度,阳性预测值,阴性预测值利用受试者工作特征曲线(ROC)来分析。Cox等比例风险回归模型来探究影响早期肝癌预后的独立危险因素。连续性变量的比较应用配对T检验或者Mann-Whitney U检验,分类变量比较用卡方检验或者Fisher精确检验。P<0.05认为有统计学差异。应用SAS 9.1和R软件(3.0.0版本)进行数据分析。结果:训练组和验证组中分别有211(29.8%)和89(30.0%)例患者病理证实有MVI。本研究的随访时间截止到2014年8月31日,中位随访时间为25.4个月。训练组中有MVI的患者5年复发率和生存率分别为78.5%,58.4%,而无MVI的患者分别为70.9%和46.9%(P<0.001)。根据多因素Logistic回归分析结果,预测MVI的术前因子有:肿瘤最大直径,多发肿瘤,包膜不完整,血清甲胎蛋白>20μg/L,血小板计数<100×109/L,乙肝病毒载量>104 IU/m L,以及肿瘤在增强MRI中典型动态模式。由这七个变量组成的列线图模型取得了很好的预测准确性和一致性。训练组和验证组中Harell C指数分别为0.81(95%CI:0.78-0.85)和0.80(95%CI:0.75-0.86)。一致性曲线图也表明MVI实际发生率和模型预测概率具有良好的一致性。根据Youden指数最大原则,选择列线图模型总分190作为预测有无MVI的最佳截断值。对应的训练组,验证组中阳性预测值分别为56.9%(51.7%-64.5%)和57.9%(49.2%-68.5%),阴性预测值分别为86.6%(82.6%-88.9%)和83.2%(76.0%-87.7%)。对于列线图预测的MVI高危病人,宽切缘肝切除可显著改善预后(5年生存率:宽切缘,62.4%vs.窄切缘,47.9%,P=0.013;5年复发率:宽切缘,61.1%vs.窄切缘,77.5%,P=0.008),而对于MVI低危病人,接受宽,窄切缘者肝切除后肿瘤复发(p=0.172)和总体生存(p=0.504)无差异。结论:针对乙肝相关早期肝癌,我们建立的列线图模型能较准确地在术前预测MVI的发生。利用该模型,可术前评估患者发生MVI的风险,从而指导合理的外科治疗方式。第三部分基于全外显子测序筛选早期肝癌微血管侵犯相关基因研究目的:为进一步探讨早期肝癌MVI发生分子机制,找出能预测MVI发生的突变基因。我们利用全外显子测序技术寻找早期肝癌中多发的单核苷酸变异(Single nucleotide variation,SNV)。在体细胞基因组水平探讨肝癌MVI发生发展的分子机制。研究方法:通过全外显子测序生成早期肝癌(≤3cm)测序数据。10例MVI阳性及6例MVI阴性早期肝癌外显子测序数据采用BWA(Burrows Wheeler alignment)比对后,进而运用突变计算软件GATK(Genome analysis toolkit)和Mu Tect(Mutation detect)发现SNV。同时,用Mut Sig CV(Mutation significance covariates)算法来筛选驱动基因。利用KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)和Reactome数据库对驱动基因进行通路富集分析。结果:外显子测序生成的16对早期肝癌测序数据。经数据比对,Mut Sig CV计算后,MVI阳性组筛选得到133个驱动基因,MVI阴性组得到34个驱动基因,包括FBN3,LAMC3,TNR,COL6A3,VCAN,NID2,KIK7,GP6等基因。通路富集分析得出这些基因和肿瘤细胞外基质(ECM)相关信号通路显著相关。结论:早期肝癌MVI的发生可能和肿瘤细胞外基质相关基因的突变有关。肿瘤微环境的改变可能在促进肿瘤细胞微转移的过程中起到更加重要的作用。这一点为进一步阐明MVI发生的分子机制和外周血中检测这些突变基因来预测MVI提供必要的理论基础。