辣椒未成熟果实特异性表达cDNA的克隆

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辣椒是世界第三大蔬菜。此外,辣椒果实提取物——辣椒红素和辣椒素在医药、农业、食品、工业等方面都有广泛用途,市场潜力很大。因此,提高辣椒果实中辣椒红素与辣椒素的含量对辣椒加工业具有重要的意义。利用常规育种手段提高辣椒素及辣椒红素含量难度大,育种周期长,很难适应市场的不断变化;而现代基因工程技术为改良辣椒果实品质,提高辣椒红素和辣椒素的合成量提供了新的途径。因此,迫切需要对与辣椒红素和辣椒素生物合成有关的基因进行克隆,为利用基因工程改造辣椒品种提供基因元件和理论依据。 目前韩国和美国的一些学者已经在辣椒红素和辣椒素合成基因克隆方面开展了研究。如美国JeanneCurry等从辣椒胎座的cDNA文库中筛选到三个辣椒素类物质合成途径中的酶编码基因(Pal,Ca4h,Comt);韩国的MinwooKim等人运用SSH的方法分离了辣椒果实胎座特异性表达的cDNA克隆,且表达强度与辣椒的辣性相关。这些研究为了解辣椒素和辣椒红素代谢途径中基因的调控作用奠定了基础。然而,要全面而系统了解基因对辣椒红素和辣椒素的代谢过程的调控机制,并最终达到利用基因工程主观地调控其代谢过程,还有待于克隆更多的相关基因及其相应的表达调控元件。 本研究以我国农家辣椒品种“四川北山县线辣椒”为材料,分别提取果实胎座、果皮和种子中的RNA,反转录后得到cDNA,然后利用DDRT-PCR的方法比较辣椒果实胎座、果肉及种子各个组织中表达基因的差异,从而克隆到分别在辣椒果实的胎座、果皮和种子特异表达的基因。 本研究共得到103条组织特异性表达片段,其中胎座特异性表达片段36条,果皮特异性表达片段44条,种子特异性表达片段13条,种胎共同表达片段11条。所得扩增片段大小绝大多数分布在100bp至800bp之间,最小的只有90bp,最长的为1000bp。 从上述103个特异片段中挑选了22条重复性和重演性较好的片段通过反向Northern杂交方法对其表达的组织特异性进行了验证,从中筛选到10个阳性片段,阳性率达45.45%(10/22),其中6个片段(SHUCA001,SHUCA002,SHUCA004,SHUCA005,SHUCA008,SHUCA022)为胎座特异性表达,3个(SHUCA010,SHUCA017,SHUCA019)为果皮特异性表达以及1个(SHUCA016)是种子特异性表达片段。 进一步将这10个阳性片段进行克隆、测序以及同源性比对,结果显示:(1)胎座特异片段SHUCA001与番茄、烟草等植物的β-1,4-D-葡聚糖酶编码基因有很高同源性;胎座特异片段SHUCA004与番茄、马铃薯等植物的UDP-葡萄糖蛋白转葡萄糖基酶编码基因同源性较高;种子特异片段SHUCA016与酿酒葡萄7号克隆白粉病抗性基因的mRNA的同源性很高;果皮特异片段SHUCA017则与许多植物的NADH脱氢酶4亚基(NADHdehydrogenasesubunit4)mRNA同源性较高。 (2)另外6个特异性阳性片段,其中4个为胎座特异表达的片段 (SHUCA002,SHUCA005,SHUCA008,SHUCA022)和2个为果皮特异表达的片段(SHUCA010,SHUCA019),这些片段都与Genebank上已登录的序列同源性很小,为本研究首次得到的新序列。目前这6个片段已经在Genebank上登录,并分别获得了序列号AY887901,AY922984,AY922988,AY922986,AY922987,AY922985。 本研究获得的这些差异cDNA片段将会为了解辣椒果实有关基因的功能和结构以及探究辣椒素和辣椒红素代谢途径及相关基因的表达和调控提供科学依据,并为通过基因工程途径调控其代谢过程提供必要的基因资源。
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