由致病细菌引起的食物中毒、感染性疾病以及生物恐怖事件严重地威胁着人类的健康,大量的医疗卫生资源被投入到致病细菌感染的预防和治疗。目前,针对致病细菌感染的预防和治疗主要依赖于抗菌药物的使用,但是随着抗菌药物在养殖业等领域的滥用和医疗机构中的不合理使用,致病细菌对抗菌药物的敏感程度正在逐步地下降,多重耐药的超级细菌“ESKAPE”的出现,更是给临床治疗带来了巨大困难,有的全耐药细菌甚至只剩下一到两个抗菌药物对其有效。我们正在步入一个严峻性的“后抗生素时代”—任何普通的感染和小外伤都可能是致命的。快速准确地鉴别致病细菌的种类是解决致病细菌所造成威胁的重要关键,一旦确定感染细菌的种类后,及时给予有效的抗菌药物是治疗感染性疾病的关键手段。但是,目前临床广泛使用的致病细菌检测和抗菌药物敏感性试验方法存在耗时太长的缺点,这极大制约了有效治疗措施的实施,造成了频繁地使用经验性抗菌药物。噬菌体是能感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的专性寄生性病毒,它们没有产生能量的器官和翻译蛋白的核糖体,具有高度的宿主特异性,生命力持久,能在宿主细菌中快速繁殖,对维持自然界生态系统中细菌种属间动态平衡起着重要作用。因此,将噬菌体及其功能性蛋白作为特异性分子识别物质,在致病细菌的快速检测和药敏试验中有着重要意义。本文以铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的检测和药敏试验为代表,筛选并验证分子识别物质的活性,建立了基于分子识别模式的致病细菌检测方法和基于烈性噬菌体检测细菌活力的药敏试验新方法,同时也建立了基于IgG和替考拉宁双位点识别的分子识别模式的药敏试验新方法。本文研究的具体内容包括如下几个方面:1.致病细菌识别物质的筛选(1)铜绿假单胞菌噬菌体PAP1的分离。我们以临床上常见的条件致病细菌—铜绿假单胞菌为宿主菌,采用改良的λ-噬菌体分离方法从医院污水中分离了能裂解铜绿假单胞菌的烈性噬菌体PAP1,然后采用液体培养的方式培养PAP1,经过一系列的NaCl解吸附、PEG8000沉淀,氯仿纯化等步骤,制备高纯度和高滴度的噬菌体PAP1混悬液。随后,我们分析了PAP1的形态学特征、最佳感染复数和一步生长曲线,确定了该噬菌体PAP1是一株有尾烈性噬菌体,具有70 nm大小的头部和130 nm长的尾部,吸附潜伏期约为20 min,裂解爆发期约为60 min。(2)尾丝蛋白P069的表达纯化。我们通过美国国家生物技术信息中心检索和局部序列比对基本检索工具,确定了铜绿假单胞菌噬菌体尾丝蛋白P069的DNA序列,根据其DNA序列的特点设计了引物,采用Nde I和Not I双酶切载体pET-21a和P069的PCR产物后构建重组载体pET-21a-P069,然后采用大肠杆菌表达体系,表达了纯化尾丝蛋白P069。实验结果表明,尾丝蛋白P069是噬菌体表面蛋白,采用大肠杆菌表达体系时,大量尾丝蛋白P069以包涵体形式存在于大肠杆菌细胞中,经包涵体复性和纯化后,得到了分子量大小为65 kD的蛋白质的PBS溶液,其分子量大小与目的尾丝蛋白P069相符。2.致病细菌检测和抗菌药物敏感性试验(3)基于噬菌体功能化磁性纳米颗粒的生物发光法检测铜绿假单胞菌。我们将分离的噬菌体PAP1通过氨基与甲苯磺基反应标记到磁性纳米颗粒上,利用噬菌体功能化磁性纳米颗粒分离富集和检测活的铜绿假单胞菌。当磁性纳米颗粒上的噬菌体通过尾丝和基板识别并捕获铜绿假单胞菌后,在磁场作用下分离富集靶细菌,经过100 min繁殖复制后,噬菌体裂解靶细菌并释放子代噬菌体和胞内ATP。随后,采用荧光素-ATP生物发光体系检测裂解液中的ATP,建立了特异性检测铜绿假单胞菌的方法。本实验建立的方法的检测范围为6.0×10~2-3.0×10~5 CFU/mL,检测限为2.0×10~2 CFU/mL,整个检测过程只需要2 h。本实验能高特异性地检测活铜绿假单胞菌,不受包括青枯假单菌和恶臭假单菌等在内的其它杂菌的干扰。同时,我们建立的方法成功地应用到葡萄糖、血浆和尿液中的铜绿假单胞菌检测。(4)基于铜绿假单胞菌活力鉴别的抗菌药物敏感性试验。目前大多数抗菌药物的药理机制均是针对细菌的核糖体或DNA复制的,因此鉴于噬菌体、宿主菌和抗菌药物三者间特殊的关系,我们将铜绿假单胞菌与抗菌药物混合后,当抗菌药物充分作用细菌后,加入噬菌体PAP1检验溶液中是否存在活菌,同时用空白溶剂作为对照。当噬菌体组的生物发光信号与溶剂组的信号有差异时,说明溶液还存在活菌,铜绿假单胞菌对抗菌药物耐药;当菌体组的生物发光信号与溶剂组的信号无显著性差异时,说明溶液中无活菌存在,铜绿假单胞菌对抗菌药物敏感。本研究能在3 h内检测出妥布霉素、庆大霉素、头孢他啶、哌拉西林和左氧氟沙星的最低抑菌浓度分别为<4μg/mL,8μg/mL,>32μg/mL,>128μg/mL和>8μg/mL。我们建立的快速药敏检测方法有望降低经验性使用抗菌药物的频率,有利于临床抗菌药物的合理使用。(5)基于噬菌体尾丝蛋白识别的铜绿假单胞菌检测。本实验首先验证了尾丝蛋白的生物活性,研究结果表明:尾丝蛋白P069没有内源性的裂解活性,能在15min内快速地识别铜绿假单胞菌。P069能特异性地识别铜绿假单胞菌,但不能区别铜绿假单胞菌菌株之间的差异。接着我们将尾丝蛋白分别包被在微孔板上和标记到磁性纳米颗粒上,利用夹心荧光检测法和生物发光检测法建立特异性检测铜绿假单胞菌的数量,两种方法的检测范围分别为4.0×10~2 CFU/mL-4.0×10~6CFU/mL和2.0×10~3 CFU/mL-2.0×10~6 CFU/mL,检测限分别为1.3×10~2 CFU/mL和6.7×10~2 CFU/mL。最后我们将所建立的生物发光法成功地应用到葡萄糖、血浆和尿液中的铜绿假单胞菌检测。(6)基于IgG和替考拉宁识别的夹心荧光法检测金黄色葡萄球菌及其药敏试验。本研究建立了一种基于分子识别模式的夹心荧光检测金黄色葡萄球菌的方法,并用该方法评估金黄色葡萄球菌对各种抗菌药物的敏感性。我们将猪IgG作为金黄色葡萄球菌的特异性分子识别试剂,将其包被在微孔板中,利用猪IgG的Fc片段与金黄色葡萄球菌表面的A蛋白间的相互作用,特异性捕获金黄色葡萄球菌,然后利用FITC标记的替考拉宁结合革兰氏阳性菌肽聚糖层的D-Ala-D-Ala,将其作为信号探针,建立夹心荧光分析法特异性检测金黄色葡萄球菌的数量,金黄色葡萄球菌的检测范围为1.0×10~3-1.0×10~7 CFU/mL,检测限为3.3×10~2 CFU/mL。该夹心荧光分析法能从葡萄糖、血清和尿液中特异性地分离检测金黄色葡萄球菌。接着,我们成功地将这一分子识别模式的夹心荧光法用于金黄色葡萄球菌的抗菌药物敏感性试验。青霉素、头孢西丁、克林霉素、甲氧苄啶/磺胺甲基异噁唑和红霉素等5组抗菌药物对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度分别为>0.25μg/mL,<4μg/mL,<0.25μg/mL,<2/38μg/mL和<0.5μg/mL。此外,由于替考拉宁的敏感性常与它对金黄色葡萄球菌结合能力有关,该夹心荧光分析法也可用于替考拉宁自身的药敏试验。整个抗菌药物敏感性试验可以在4 h内完成,省去了耗时的致病细菌分离和鉴别过程,本研究建立的方法有望为快速准确地制定感染性疾病治疗方案提供数据支持。综上所述,将IgG、噬菌体、噬菌体尾丝蛋白、替考拉宁等分子作为致病细菌的特异性分子识别物质,利用它们对靶细菌的特异性结合能力,能快速地将靶细菌从复杂的基质中分离富集出来,然后结合不同的发光分析方法,可建立快速、准确、特异性的致病细菌检测方法。同时我们建立了基于噬菌体检测致病细菌活力和分子识别模式的药敏试验新方法,这些方法极大地缩短了抗菌药物敏感性试验所需的时间,在临床感染性疾病的治疗方面有着良好的应用前景。此外,我们成功地克隆表达了噬菌体尾丝蛋白这一特异性分子识别试剂,尾丝蛋白有望在致病细菌检测和药敏试验方面起着重要作用。