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大电导、电压依赖、钙敏感的钾离子通道(Maxi-K or BK)参与调控多种生理学过程包括平滑肌收缩、神经递质分泌以及听觉的形成。BK通道除a亚基外还有多个辅助亚基(b),这些辅助亚基的调节作用很大程度上增加了BK通道的多样性,这也是BK通道在多种组织中行使不同功能的基础。目前,BK通道b辅助亚基的结构和调节机制依然是重要的研究课题。本文通过分子生物学、荧光成像和电生理技术等手段详尽研究了BK通道hb2辅助亚基的跨膜结构、转运机制和调节特性。在此基础上原核表达了hb2和hb4亚基的胞外区域并结晶。
我们的研究证实了hb2辅助亚基的二次跨膜结构,它包含一个巨大的、疏水的胞外区段。我们还发现,hb2亚基必须通过与a亚基组装成BK通道才能转运到细胞膜,而当其单独表达时将滞留在内质网(ER)中。进一步研究我们发现hb2亚基的胞内NH2端存在内质网滞留信号,它是由五个氨基酸“QKIRD”组成的基本序列(motif),并且该motif是一段长13个氨基酸残基的a螺旋的一部分。我们认为,通过与BK通道a亚基的紧密作用,hb2亚基的NH2端滞留信号被包埋起来,从而使得hb2亚基能够顺利转运到细胞膜。
免疫荧光实验证明b2亚基胞外区段的第137位氨基酸残基附近区域是亲水性最强的区域,并可能是最靠近BK通道外孔区的部分。通过丙氨酸替换(定点突变)和电生理实验,我们证明hb2亚基137位附近多个赖氨酸残基在BK通道孔区周围组成了正电荷环,对BK通道的电导有显著的修饰作用。这些位于通道入口处的正电荷环通过静电场作用,排斥通道入口附近的钾离子或带正电荷的北非蝎毒素(ChTX),降低了BK通道外口附近的钾离子浓度,引起BK通道外向整流并降低BK通道对ChTX的敏感性。Hb2亚基的外向整流作用减小了BK通道的内向电流,从而使得兴奋的细胞更易于复极化。
为了进一步研究BK通道b亚基的结构特征,我们对hb2和hb4亚基的胞外区域进行了原核表达、纯化和结晶,试图解析b亚基的晶体结构。这将为深入了解BK通道b亚基的调节功能以及a亚基和b亚基的相互作用提供结构上的线索,也为针对BK通道的天然毒素开发和应用、药物设计提供理论基础。