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肌腱损伤后形成粘连是临床常见并发症，由于缺乏有效的粘连防治措施，严重影响患者的功能康复。美国每年因创伤和过量运动导致的肌腱损伤超过32万例，造成数十亿元的医疗费用，且有30-40%的病人因肌腱粘连遗留关节活动受限等并发症。降低肌腱粘连的发生率，促进肌腱自身愈合，是研究的焦点。
通过对肌腱结构及粘连机制的深入研究，探索了很多防止肌腱粘连的方法和材料。来源于生物体的天然物质羊膜是一种半透膜，含有丰富的胶原、细胞因子、酶类等活性成分，允许营养物质渗透，其独有的结构使其成为理想的生物材料。课题组在临床应用中发现羊膜缺少足够的力学强度，溶解过快导致滑移、不能平铺于创面等缺点，为克服上述羊膜材料的局限性，需要引入其他材料来发挥羊膜材料的最大潜能。
本课题将新鲜羊膜经过冷冻、真空干燥处理后，通过静电纺丝技术，在冻干羊膜两个表面接收聚己内酯(polycaprolactone, PCL)纳米纤维，形成羊膜/PCL纳米纤维复合膜，构建符合肌腱愈合周期的生长因子缓释系统。对该复合膜进行表征、对肌腱细胞和成纤维细胞生物学行为的影响进行评估、测定，并建立兔趾肌腱损伤模型评估体内防治肌腱损伤的效果。
本研究发现：1.新鲜羊膜经冷冻、真空干燥处理后，有效去除了羊膜中的多数细胞成分，而保留了转化生长因子(transforminggrowthfactor-β,TGF-β)、成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)等活性成分、基底膜层以及致密层的纤维网状结构。接收PCL纳米纤维后构建了仿生腱鞘结构的纳米纤维复合膜，増强了羊膜的抗拉性能，为细胞生长提供了足够的三维网络空间结构。2.上调了ERK1/2和SMAD2/3的磷酸化，促进了肌腱细胞和成纤维细胞的粘附和增殖，提高了胶原蛋白的合成。3.兔肌腱损伤模型实验表明，PCL纳米纤维膜作为外层，可以像天然腱鞘一样防止成纤维细胞及其它粘连组织侵入；羊膜作为中间层，通过释放TGF-β1、bFGF、PDGF、VEGF等生物活性物质，经纳米纤维膜的孔隙扩散至修复部位，提高肌腱细胞增殖和胶原蛋白合成活性，促进肌腱内源性愈合；PCL纳米纤维膜作为内层，通过其适度的亲水性和光滑性来维持肌腱滑动。
本课题利用静电纺丝技术构建仿生腱鞘结构的羊膜/PCL纳米纤维复合膜，増强了羊膜的机械强度，通过机械屏障作用隔离了外源性粘连组织，缓释多种生长因子促进了内源性愈合，为解决肌腱粘连这一临床难题提供了新的治疗策略，具有广阔的应用前景。
第一部分冻干羊膜预防手指Ⅱ区屈肌腱粘连的临床研究
目的：肌腱与周围组织的粘连是肌腱修复术后最常见的并发症，迄今为止仍无有效的解决方法。本研究采用冻干羊膜移植促进Ⅱ区屈肌腱愈合、预防粘连，有望成为防治肌腱粘连的新方法。
方法：本研究收集来自于河北医科大学第三医院、唐山市工人医院、唐山市第二医院共计89例手指Ⅱ区屈肌腱损伤患者。根据术中肌腱处理方式不同分为对照组、PDLLA(poly-D,L-lactic acid)组和羊膜组。分别在术后第1、2、3和6个月随访患者，通过测量指间关节活动范围以及并发症的发生率并进行优劣分级来评估预防肌腱粘连的临床效果。
结果：PDLLA组和羊膜组指间关节活动范围无明显差异，与对照组相比差异均具有统计学意义；对照组和PDLLA组、羊膜组在临床疗效分级评估中具有显著的统计学意义；对照组和PDLLA组的并发症发生率明显高于羊膜组，对照组和PDLLA组之间未观察到显著差异。
结论：冻干羊膜具备良好的生物相容性和修复性能，对人体自身和局部组织不会产生不良反应，通过屏障外源性侵入组织，释放各种细胞因子加速肌腱的内源性愈合，能够有效减少肌腱粘连。
第二部分羊膜/PCL纳米纤维复合膜的制备和表征
目的：应用物理屏障阻断外源性愈合是目前防治肌腱粘连的主要措施，由于材料结构不同，其作用机制及临床效果各异。临床应用中发现冻干羊膜存在力学强度低、溶解过快导致滑移等缺点，为解决这些问题，本课题通过静电纺丝技术，将PCL纳米纤维膜包覆于羊膜两侧，制备了羊膜/PCL纳米纤维复合膜，以发挥羊膜材料的最大潜能。
方法：新鲜羊膜经过冷冻、真空干燥处理后，通过静电纺丝技术，依次在冻干羊膜两个表面接收PCL纳米纤维，形成羊膜/PCL纳米纤维复合膜，构建符合肌腱愈合周期的生长因子缓释系统，并对该复合膜进行表征测定。
结果：新鲜羊膜经冷冻、真空干燥处理后，有效去除了羊膜中的多数细胞成分，而基底膜层和致密层的三维多孔结构得以保留，复合膜的纤维网状结构为细胞生长提供了足够的三维空间结构。冻干羊膜和复合膜的亲水角分别为51.18±2.72°和59.44±4.15°，压力-应变实验显示复合膜较冻干羊膜有更高的拉伸强度。EDS分析发现羊膜中C、N、O、S和P等元素分布均匀，FT-IR测定复合膜的红外光谱中兼有属于外层PCL和中间层羊膜的特征峰，没有出现其他新的特征峰，表明整个实验过程及PCL本身没有对羊膜，尤其是羊膜含有的活性蛋白产生不利影响。
结论：通过静电纺丝膜化处理，明显改善了冻干羊膜的拉伸强度、弹性模量，同时适度增加了疏水性，更有利于术中操作。
第三部分羊膜/PCL纳米纤维复合膜的生物学检测
目的：肌腱细胞、成纤维细胞是肌腱损伤后，愈合和粘连过程中重要的活化细胞，羊膜包含的许多生长因子参与调节肌腱修复过程中的细胞应答。本课题通过研究羊膜/PCL纳米纤维复合膜对肌腱细胞、成纤维细胞的生物活性、粘附及增殖的影响，探讨羊膜材料促进肌腱愈合的作用机制，为该纳米纤维复合膜的体内实验提供前期理论基础。
方法：从新西兰大白兔趾屈肌腱及腱周结蹄组织提取肌腱细胞、成纤维细胞，分别在冻干羊膜、羊膜/PCL纳米纤维复合膜上培养，另做空白对照组，分别于第1、3、5、7、10、15天时用CCK-8法进行细胞活性检测。提取细胞内蛋白，用蛋白质印迹法分析TGF-β1、bFGF、VEGF、PDGF、COL1、SMAD2/3、p-SMAD2/3、ERK1/2、P-ERK1/2蛋白的表达情况。
结果：肌腱细胞和成纤维细胞培养的第1、3天时，各细胞活性没有统计学差别；培养第5、7、10、15天时，冻干羊膜组和羊膜/PCL复合膜组细胞生长更快，活性更高(P＜0.05)；同时发现在培养的前7天，冻干羊膜组细胞增长趋势更快，7天后羊膜/PCL复合膜组增长趋势更快。共聚焦激光显微镜观察结果显示，细胞与冻干羊膜、羊膜/PCL复合膜生物相容性好，较对照组展现了更好的生长活性。蛋白质印迹测定结果显示冻干羊膜组和羊膜/PCL复合膜组TGF-β1、bFGF、VEGF、PDGF、COL1、p-SMAD2/3、P-ERK1/2表达水平均高于对照组，SMAD2/3、ERK1/2表达水平没有明显差异。
结论：羊膜/PCL纳米纤维复合膜通过缓释TGF-β1、bFGF、VEGF、PDGF等生长因子，调控SMAD通路和RAS-MEK-ERK通路，使相对静止属性的肌腱细胞表现出增强的生物活性，为促进肌腱愈合和防治粘连提供了新的方向。
第四部分羊膜/PCL纳米纤维复合膜防治肌腱粘连的体内实验
目的：腱鞘是维持肌腱滑动和营养的重要结构，本章的研究目的是将仿生腱鞘结构的羊膜/PCL纳米纤维复合膜应用于动物肌腱损伤模型，明确其促进肌腱愈合和防止粘连的效果。
方法：成年新西兰兔，随机分为对照组、冻干羊膜组和羊膜/PCL复合膜组，趾深屈肌肌腱切断后，分别缝合肌腱断端、包裹冻干羊膜和包裹羊膜/PCL纳米纤维复合膜处理。术后3周处死动物，行第3趾属肌腱大体观察、组织学观察和生物力学测定。
结果：术后3周，通过对各组修复肌腱的大体观察和组织切片对比发现，对照组中肌腱与周围组织之间存在严重粘连，冻干羊膜组中肌腱和周围组织存在松散的纤维组织束，羊膜/PCL复合膜组腱周平滑，几乎没有粘连组织形成。羊膜/PCL复合膜组和冻干羊膜组愈合质量明显优于对照组，具有显著的统计学差异(P＜0.016)。在手术后的每个时间点，羊膜/PCL复合膜组和冻干羊膜组的肌腱滑动距离和总屈曲角度与对照组相比有明显的统计学差异(P＜0.05)。羊膜/PCL复合膜组和冻干羊膜组的肌腱最大拉伸断裂强度较对照组低，并无统计学差异。
结论：在兔肌腱修复模型中，羊膜/PCL纳米纤维复合膜有效的隔离了外源性粘连组织，促进了肌腱的内源性愈合。为解决肌腱粘连这一临床难题提供了新的治疗策略，具有广阔的应用前景。
通过对肌腱结构及粘连机制的深入研究，探索了很多防止肌腱粘连的方法和材料。来源于生物体的天然物质羊膜是一种半透膜，含有丰富的胶原、细胞因子、酶类等活性成分，允许营养物质渗透，其独有的结构使其成为理想的生物材料。课题组在临床应用中发现羊膜缺少足够的力学强度，溶解过快导致滑移、不能平铺于创面等缺点，为克服上述羊膜材料的局限性，需要引入其他材料来发挥羊膜材料的最大潜能。
本课题将新鲜羊膜经过冷冻、真空干燥处理后，通过静电纺丝技术，在冻干羊膜两个表面接收聚己内酯(polycaprolactone, PCL)纳米纤维，形成羊膜/PCL纳米纤维复合膜，构建符合肌腱愈合周期的生长因子缓释系统。对该复合膜进行表征、对肌腱细胞和成纤维细胞生物学行为的影响进行评估、测定，并建立兔趾肌腱损伤模型评估体内防治肌腱损伤的效果。
本研究发现：1.新鲜羊膜经冷冻、真空干燥处理后，有效去除了羊膜中的多数细胞成分，而保留了转化生长因子(transforminggrowthfactor-β,TGF-β)、成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)等活性成分、基底膜层以及致密层的纤维网状结构。接收PCL纳米纤维后构建了仿生腱鞘结构的纳米纤维复合膜，増强了羊膜的抗拉性能，为细胞生长提供了足够的三维网络空间结构。2.上调了ERK1/2和SMAD2/3的磷酸化，促进了肌腱细胞和成纤维细胞的粘附和增殖，提高了胶原蛋白的合成。3.兔肌腱损伤模型实验表明，PCL纳米纤维膜作为外层，可以像天然腱鞘一样防止成纤维细胞及其它粘连组织侵入；羊膜作为中间层，通过释放TGF-β1、bFGF、PDGF、VEGF等生物活性物质，经纳米纤维膜的孔隙扩散至修复部位，提高肌腱细胞增殖和胶原蛋白合成活性，促进肌腱内源性愈合；PCL纳米纤维膜作为内层，通过其适度的亲水性和光滑性来维持肌腱滑动。
本课题利用静电纺丝技术构建仿生腱鞘结构的羊膜/PCL纳米纤维复合膜，増强了羊膜的机械强度，通过机械屏障作用隔离了外源性粘连组织，缓释多种生长因子促进了内源性愈合，为解决肌腱粘连这一临床难题提供了新的治疗策略，具有广阔的应用前景。
第一部分冻干羊膜预防手指Ⅱ区屈肌腱粘连的临床研究
目的：肌腱与周围组织的粘连是肌腱修复术后最常见的并发症，迄今为止仍无有效的解决方法。本研究采用冻干羊膜移植促进Ⅱ区屈肌腱愈合、预防粘连，有望成为防治肌腱粘连的新方法。
方法：本研究收集来自于河北医科大学第三医院、唐山市工人医院、唐山市第二医院共计89例手指Ⅱ区屈肌腱损伤患者。根据术中肌腱处理方式不同分为对照组、PDLLA(poly-D,L-lactic acid)组和羊膜组。分别在术后第1、2、3和6个月随访患者，通过测量指间关节活动范围以及并发症的发生率并进行优劣分级来评估预防肌腱粘连的临床效果。
结果：PDLLA组和羊膜组指间关节活动范围无明显差异，与对照组相比差异均具有统计学意义；对照组和PDLLA组、羊膜组在临床疗效分级评估中具有显著的统计学意义；对照组和PDLLA组的并发症发生率明显高于羊膜组，对照组和PDLLA组之间未观察到显著差异。
结论：冻干羊膜具备良好的生物相容性和修复性能，对人体自身和局部组织不会产生不良反应，通过屏障外源性侵入组织，释放各种细胞因子加速肌腱的内源性愈合，能够有效减少肌腱粘连。
第二部分羊膜/PCL纳米纤维复合膜的制备和表征
目的：应用物理屏障阻断外源性愈合是目前防治肌腱粘连的主要措施，由于材料结构不同，其作用机制及临床效果各异。临床应用中发现冻干羊膜存在力学强度低、溶解过快导致滑移等缺点，为解决这些问题，本课题通过静电纺丝技术，将PCL纳米纤维膜包覆于羊膜两侧，制备了羊膜/PCL纳米纤维复合膜，以发挥羊膜材料的最大潜能。
方法：新鲜羊膜经过冷冻、真空干燥处理后，通过静电纺丝技术，依次在冻干羊膜两个表面接收PCL纳米纤维，形成羊膜/PCL纳米纤维复合膜，构建符合肌腱愈合周期的生长因子缓释系统，并对该复合膜进行表征测定。
结果：新鲜羊膜经冷冻、真空干燥处理后，有效去除了羊膜中的多数细胞成分，而基底膜层和致密层的三维多孔结构得以保留，复合膜的纤维网状结构为细胞生长提供了足够的三维空间结构。冻干羊膜和复合膜的亲水角分别为51.18±2.72°和59.44±4.15°，压力-应变实验显示复合膜较冻干羊膜有更高的拉伸强度。EDS分析发现羊膜中C、N、O、S和P等元素分布均匀，FT-IR测定复合膜的红外光谱中兼有属于外层PCL和中间层羊膜的特征峰，没有出现其他新的特征峰，表明整个实验过程及PCL本身没有对羊膜，尤其是羊膜含有的活性蛋白产生不利影响。
结论：通过静电纺丝膜化处理，明显改善了冻干羊膜的拉伸强度、弹性模量，同时适度增加了疏水性，更有利于术中操作。
第三部分羊膜/PCL纳米纤维复合膜的生物学检测
目的：肌腱细胞、成纤维细胞是肌腱损伤后，愈合和粘连过程中重要的活化细胞，羊膜包含的许多生长因子参与调节肌腱修复过程中的细胞应答。本课题通过研究羊膜/PCL纳米纤维复合膜对肌腱细胞、成纤维细胞的生物活性、粘附及增殖的影响，探讨羊膜材料促进肌腱愈合的作用机制，为该纳米纤维复合膜的体内实验提供前期理论基础。
方法：从新西兰大白兔趾屈肌腱及腱周结蹄组织提取肌腱细胞、成纤维细胞，分别在冻干羊膜、羊膜/PCL纳米纤维复合膜上培养，另做空白对照组，分别于第1、3、5、7、10、15天时用CCK-8法进行细胞活性检测。提取细胞内蛋白，用蛋白质印迹法分析TGF-β1、bFGF、VEGF、PDGF、COL1、SMAD2/3、p-SMAD2/3、ERK1/2、P-ERK1/2蛋白的表达情况。
结果：肌腱细胞和成纤维细胞培养的第1、3天时，各细胞活性没有统计学差别；培养第5、7、10、15天时，冻干羊膜组和羊膜/PCL复合膜组细胞生长更快，活性更高(P＜0.05)；同时发现在培养的前7天，冻干羊膜组细胞增长趋势更快，7天后羊膜/PCL复合膜组增长趋势更快。共聚焦激光显微镜观察结果显示，细胞与冻干羊膜、羊膜/PCL复合膜生物相容性好，较对照组展现了更好的生长活性。蛋白质印迹测定结果显示冻干羊膜组和羊膜/PCL复合膜组TGF-β1、bFGF、VEGF、PDGF、COL1、p-SMAD2/3、P-ERK1/2表达水平均高于对照组，SMAD2/3、ERK1/2表达水平没有明显差异。
结论：羊膜/PCL纳米纤维复合膜通过缓释TGF-β1、bFGF、VEGF、PDGF等生长因子，调控SMAD通路和RAS-MEK-ERK通路，使相对静止属性的肌腱细胞表现出增强的生物活性，为促进肌腱愈合和防治粘连提供了新的方向。
第四部分羊膜/PCL纳米纤维复合膜防治肌腱粘连的体内实验
目的：腱鞘是维持肌腱滑动和营养的重要结构，本章的研究目的是将仿生腱鞘结构的羊膜/PCL纳米纤维复合膜应用于动物肌腱损伤模型，明确其促进肌腱愈合和防止粘连的效果。
方法：成年新西兰兔，随机分为对照组、冻干羊膜组和羊膜/PCL复合膜组，趾深屈肌肌腱切断后，分别缝合肌腱断端、包裹冻干羊膜和包裹羊膜/PCL纳米纤维复合膜处理。术后3周处死动物，行第3趾属肌腱大体观察、组织学观察和生物力学测定。
结果：术后3周，通过对各组修复肌腱的大体观察和组织切片对比发现，对照组中肌腱与周围组织之间存在严重粘连，冻干羊膜组中肌腱和周围组织存在松散的纤维组织束，羊膜/PCL复合膜组腱周平滑，几乎没有粘连组织形成。羊膜/PCL复合膜组和冻干羊膜组愈合质量明显优于对照组，具有显著的统计学差异(P＜0.016)。在手术后的每个时间点，羊膜/PCL复合膜组和冻干羊膜组的肌腱滑动距离和总屈曲角度与对照组相比有明显的统计学差异(P＜0.05)。羊膜/PCL复合膜组和冻干羊膜组的肌腱最大拉伸断裂强度较对照组低，并无统计学差异。
结论：在兔肌腱修复模型中，羊膜/PCL纳米纤维复合膜有效的隔离了外源性粘连组织，促进了肌腱的内源性愈合。为解决肌腱粘连这一临床难题提供了新的治疗策略，具有广阔的应用前景。