犬瘟热是由犬瘟热病毒引起的一种急性、热性、接触性传染病,严重威胁着犬、貂、狐狸和貉等动物的健康。随犬瘟热病毒在不同宿主间不断传播,宿主范围由犬科、鼬科以扩大到整个食肉目,甚至发生了对非人灵长类动物—恒河猴和食蟹猴的跨种感染。为了解我国犬瘟热病毒的遗传进化特点与致病特性,我们在国内率先建立了犬瘟病毒分离方法,分离了多株来源于犬、狐狸和猕猴的犬瘟热病毒,并对分析了其进化特点与对本动物的致病特性,进而建立了感染模型并初步探讨了免疫血清治疗效果,还评估了犬瘟热病毒强毒株的干扰素拮抗能力。本研究从犬病料中分离到2株(CDV-TM-CC、CDV-Dog-SCh)、狐狸病料中分离到2株(CDV-Fox-WF、CDV-Fox-SY)、猴病料中分离到1株(CDV-Monkey-BJ)犬瘟热病毒。对5株病毒分离株进行了电子显微镜观察、间接免疫荧光鉴定和PCR鉴定。我们发现利用Vero-DST细胞分离病毒的成功率远高于Vero细胞系,且犬源病毒Vero细胞分离株在、Vero细胞上低代次不形成细胞病变,传至第10开始出现病变。我们还发现猴源分离株在表达犬SLAM受体的Vero-DST细胞系上的复制增殖能力明显低于犬源分离源株,在Vero-DST细胞系上CDV-Monkey-BJ102.5TCID50/ml,而CDV-TM-CC103.5TCID50/ml,提示猴源病毒对犬的SLAM受体易感度不高。我们对CDV-TM在、Vero-DST细胞系和Vero、 DK、MDCK细胞上进行培养,结果显示Vero-DST细胞系上生长滴度最高。根据标准毒株序列AF164967(A75/17)设计全基因测序引物,测序结果拼接后进行基因序列分析。5株分离病毒H基因与GenBank公布的序列进行分析,结果表明上述分离株均属Asia I型强毒株,F基因与H基因的潜在N-末端糖基化位点、半胱氨酸残基及位置均与强毒株一致。猴源犬瘟热病毒的氨基酸F1片段内有7个特有位点：317R、347I、465I、466T、471P、472W、586N。V基因分析也表明其与强毒株亲缘关系较近,报道V蛋白氨基酸序列的110Y在其抗干扰素通路中起重要作用。Y110D的突变导致V蛋白仅有部分结合干扰素通路中的STAT2的结合能力,对STAT1的结合能力将完全丧失,从而对干扰素的抑制作用下降。对比麻疹病毒发现272位两者存在C/R的差异。通过空间构型分析,C272R的突变使其Zn2+结合能力下降,锌指结构空间构型稳定性受到影响。另外通过麻疹病毒的研究表明V蛋白C272R的突变可导致V蛋白不能抑制IFN,R272C的突变可使其V蛋白具有IFN抑制作用。只有V蛋白272是半胱氨酸残基才能加速IRF-3的核转动作用。V蛋白不影响TICAM-1或RIG-I诱导IFN-β启动活性,因此,272位的半胱氨酸残基是V蛋白阻断MDA5功能的关键位点。Vero培养不同代次的CDV进行致病性研究,结果表明Vero细胞对CDV有较强的致弱作用,20代即不能引起家犬发病。犬源犬瘟热病毒在Vero上传25代,5代、10代、20代进行全基因测序,发现共有25个位点的差异,其中与融合有关的F蛋白内有三个位点的变化：Y99S、H115Q、S116Y,且10代,20代位点相同,因此这三个位点可能与细胞病变的形成有关。以家犬为实验动物,通过感染途径的筛选、感染剂量的优化,确定以藏獒源犬瘟热病毒Vero分离株为标准毒株,以104TCID50剂量通过滴鼻点眼法感染2-4月龄幼家犬,建立了稳定的家犬感染模型。感染动物表现典型的犬瘟热临床症状,感染后3-5天开始排毒,高热症状、腹泻、眼鼻有脓性分泌物,很少表现出神经症状。以此模型为基础进行了病毒在体内的分布,排毒规律检测。数据显示鼻甲骨、颌下淋巴结、肺、胸腺、脾、肠系膜淋巴结、肠呈强阳性。小脑、下丘脑附近组织、皮肤胞疹呈弱阳性。大脑、胰、肝、膀胱为阴性。病毒感染家犬后第3天便可从粪便或鼻内检测到病毒的存在,而眼和咽分泌物则需要到7天左右。病理学免疫组化结果可见肺、肠、脾呈强阳性。利用家犬感染模型进行不同方案的治疗试验。高剂量治疗组存活率33.3%,病程较对照组延长1-2天；低剂量治疗组,病程较对照组延长1天；血清辅以聚肌胞和Vit E综合治疗组,存活率25%,病程较对照组延长1-4天;疫苗治疗组存活率20%,且21天后检测犬瘟热病毒为阴性。对上述组死亡动物进行剖检可见所有组病变均轻于对照组。综上所述,单因素治疗并不能完全治愈发病犬,仅能延长病程,治疗时需辅以合理的抗生素类、提高机体免疫类、营养类药物。在家犬动物模型的基础上进行了雪貂、猕猴感染试验。分离到的猴源、犬源犬瘟热均能使雪貂发病,并产生明显的临床症状。用感染犬瘟热死亡犬和猴肺、脾病料研磨液分别通过滴鼻点眼进行猕猴感染试验,结果攻毒8天后所有实验动物血液中病毒检测均为阳性。22天后猴源病料感染组血清抗体为1：256,而犬病料感染组抗体为阴性。两组均无明显临床症状,但有高热现象。该结果证明犬瘟病毒的确可感染非人灵长类动物—猴感染犬瘟热病毒,因而其跨种传播现象应引起关注。文献报道认为犬瘟热病毒具有较强的抗干扰素能力,我们的分别检测了干扰素对犬瘟热强毒株、强毒Vero细胞驯化株和疫苗弱毒株的的抑制效果。实验中以250IU、1IU、0IU的干扰素感作3组Vero细胞,24小时后弃上清每组分别加入1000TCID50的CDV-TM5代、20代Vero细胞分离毒及疫苗株(CDV-HL),结果表明干扰素对疫苗株和驯化株具有明显的抑制效果,但对强毒株的抑制明显减弱,且通过序列分析发现CDV-TM-CC5代和20代与干扰素信号通路相关的V基因存在4个氨基酸的差异,这些位点尚未见报道。通过上述研究,我们率先在国内分离了5株来源不同动物宿主的犬瘟热病毒,通过全序列分析证明我国的犬瘟热病毒均属于Asia I型,但同时发现犬源强毒与猴源强毒存在基因差异。建立了感染模型并进行治疗研究。还通过动物回归实验证明了犬瘟热病毒对猴的跨种感染。证明犬瘟热病毒强毒株具有明显的抗干扰素能力。本研究为犬瘟热病毒的综合防控研究提供了毒株与基因序列资源,建立了感染模型平台,还证实了该病毒的跨种感染现象,为进一步研究此类病毒的跨种传播机制提供了理论依据。