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内含子剪接是真核生物基因mRNA成熟过程中必须的一个步骤,也是真核生物基因表达调控过程的一个重要层面,在基因表达中的作用是广泛而深远的。内含子剪接与基因的转录起始和转录延伸、mRNA的出核运输、mRNA的质量监控都是紧密联系的。报道显示内含子可以影响到mRNA的翻译效率甚至翻译的蛋白产物的稳定性。在我们实验室的前期工作中,我们已经克隆得到了一系列不同内含子结构类型的拟南芥RPL36B基因,他们的不同点就在于第一个内含子结构的差别。我们把这一列的构建转化到酵母内源RPL36敲除菌中,重点研究这些不同内含子结构类型的构建表达的拟南芥RPL36B蛋白在结构和功能上的差异。前期结果表明内含子可以正常剪接的拟南芥RPL36B构建的酵母转化菌株生长正常,60S核糖体亚基合成相对正常,而内含子不能剪接的转化菌株生长相对缓慢,尤其在低温下更为明显,并且其60S亚基合成有明显的缺陷。而在本论文的实验中我们发现这些60S亚基合成有缺陷的菌株其组装生成的核糖体在翻译起始和ATG的选择上存在异常,而且在翻译时容易发生移码。接下来我们检测了不同拟南芥RPL36B基因构建的酵母转化菌株中拟南芥RPL36B蛋白在表达量上的差异,发现造成内含子不能剪接的RPL36B基因构建的转化菌株60S亚基合成有缺陷的原因并不是由于这类构建表达的RPL36B蛋白在量上不足引起的。同时Northern Blot检测发现这些内含子不能剪接的拟南芥RPL36B基因构建的mRNA产物不稳定,虽然能够出核翻译,但容易受到细胞质中无意义密码子介导的mRNA降解(Nonsense Mediated mRNA Decay, NMD)路径的作用而被降解。我们怀疑一个不稳定的mRNA翻译出来的蛋白可能是不正常的。通过将内含子可以剪接的拟南芥RPL36B构建转化到内含子不能剪接的拟南芥RPL36B构建酵母转化菌株中,我们发现菌株原有的生长缺陷表型得到明显恢复,同时Western Blot检测该菌株原有的内含子不能剪接的构建表达的蛋白量明显减少；而转进去的构建表达的蛋白占了大部分,在蛋白数量和功能上替代和补偿了原有构建表达的拟南芥RPL36B蛋白,表明内含子不能有效剪接的拟南芥RPL36B构建表达的蛋白在功能上的确是有异常的。然后我们检测了这类异常的蛋白与正常的蛋白在蛋白翻译后修饰上的可能区别,初步的质谱检测和Western blot分析发现二者至少在乙酰化修饰上并没有明显的差异。接下来我们怀疑内含子不能剪接的酵母转化菌株之所以出现60S核糖体合成上的缺陷是因为异常蛋白不能有效组装进核糖体中导致的,因此我们试图检测异常蛋白与正常蛋白在细胞内分布和参与组装核糖体行为上的差异,初步结果显示正常蛋白和异常蛋白在细胞质中都有未组装进核糖体的游离形态,但量都非常低,限于检测条件暂时较难精确比较二者在量上的具体差异。同时我们也用SDS-PAGE结合银染检测了正常拟南芥RPL36B蛋白和异常蛋白可能结合的其他蛋白因子的差异,希望从中找出一些特定的蛋白,为解释异常蛋白与正常蛋白功能上的差异提供一些新的线索。随着实验条件的摸索优化和实验的深入,我们希望能从机制上回答内含子剪接是如何影响到翻译产生的蛋白的功能的。