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伪狂犬病病毒（Pseudorabies Virus,PRV）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome Virus,PRRSV）是影响世界养猪业发展的两大重要传染病病原,分别引起猪的伪狂犬病（PR）和猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）。PR和PRRS是引起母猪发生繁殖障碍、育肥猪发生呼吸道疾病及初生仔猪出现神经症状和高死亡率的主要病毒性传染病。这两种传染病在我国各种类型猪场中广泛存在,给我国养殖业造成巨大的经济损失,严重制约我国养殖业的发展。PRRS在世界上多个国家和地区都存在流行或暴发,由此造成经济损失的同时也带来了严重的生物安全问题。世界各国为了控制PRRS在世界上的流行和暴发,每年都投入大量的资金和资源并采取了积极的防控措施。针对传染病控制“防重于治”的原则对于PRRS疫苗的研发从其暴发时就已开始。在中国,各种类型的疫苗有很多,但仍以灭活疫苗和减毒活疫苗为主。从目前应用的效果看,目前PRRS疫苗的免疫效果不好,保护率不高,对PRRSV的感染只能起到部分保护作用。为弥补目前PRRS疫苗的缺点,开发新型PRRS疫苗则势在必行。近年来,随着基因工程技术的发展,PRRS基因工程疫苗的研发成为目前研究的热点。与灭活疫苗和减毒活疫苗相比,PRRS基因工程疫苗作为一种新型疫苗有更多优势,对PRRS基因工程疫苗的研发主要是重组活载体疫苗和核酸疫苗。2011年底以来,很多免疫猪伪狂犬病基因缺失活疫苗的猪场再次出现了疑似猪伪狂犬病的暴发,通过毒株分离和测序分析表明PRV在多个基因位点出现了不同程度的变异从而引起其毒力发生改变。结合临床调查结果发现,市场存在的猪伪狂犬病基因缺失活疫苗不能对目前PRV变异毒株提供100%保护。因此开发一种以目前流行毒株为亲本毒株的新型伪狂犬病基因缺失活疫苗对于目前PR的防治显得尤为重要。基于伪狂犬病基因缺失活疫苗的成功应用,使以PRV流行毒株为载体构建表达外源免疫原性基因的重组PRV成为目前猪伪狂犬病基因工程疫苗研究的热点。本研究选择与PRRSV中和抗体产生相关的膜蛋白GP5和M作为插入的外源免疫原基因,将GP5、M、修饰型GP5（GP5m）及猪白细胞介素18基因（IL-18）以不同的组合方式克隆至真核表达载体pTK,构建了五种重组转移载体:（1）pTK-GP5-M（2）pTK-GP5-M-IL-18（3）pTK-GP5m（4）pTK-GP5m-IL-18（5）pTK-IL-18。将重组转移载体pTK-GP5-M、pTK-GP5-M-IL-18、pTK-GP5m、pTK-GP5m-IL-18免疫家兔,进行初步免疫原性试验。在此基础上以本试验室分离到的PRV流行毒株构建的基因缺失株rPRV-gE-/TK-/GFP+为载体在293T细胞中通过同源重组的方式构建了五种重组伪狂犬病病毒（1）rPRV-gE-/TK-/GP5+/M+（2）rPRV-gE-/TK-/GP5+/M+/IL-18+（3）PRV-gE-/TK-/GP5m+（4）rPRV-gE-/TK-/GP5m+/IL-18+（5）rPRV-gE-/TK-/IL-18+并进行免疫原性研究。为了测定五种重组病毒的免疫原性,将45只雌性试验小鼠随机分成9组,每组5只,将已获得的5种不同的重组病毒按105.5TCID50/只的免疫剂量免疫小白鼠。第1组:rPRV-gE-/TK-/GP5+/M+;第2组:rPRV-gE-/TK-/GP5+/M+/IL-18+;第3组:rPRV-gE-/TK-/GP5m+;第4组:rPRV-gE-/TK-/GP5m+/IL-18+;第五组:rPRV-gE-/TK-/IL-18+;第六组:105.5TCID50rPRV-TK-/gE-;第七组:免疫104.6TCID500 PRRSV VR2332疫苗株;第八组:免疫105.5TCID50PRV HB-98疫苗株;第九组:DMEM。免疫途径均为皮下注射+滴鼻免疫,4周后加强免疫一次。首次免疫当天开始采血,每周小鼠尾静脉采血一次,间接ELISA检测特异性抗PRRSV ELISA抗体水平;每两周采血中和试验检测特异性抗PRRSV、PRV中和抗体水平;以此评价重组病毒对小白鼠的体液免疫水平;在2免后4周无菌分离小鼠脾脏T淋巴细胞,进行体外T淋巴细胞增殖试验及T淋巴细胞细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-10表达检测试验以此评价免疫小白鼠的细胞免疫水平。抗PRRSV特异性中和抗体试验结果表明:首次免疫28d,VR2332疫苗株对照组抗PRRSV中和抗体水平达到3log2;rPRV-gE-/TK-/GP5+/M+、rPRV-gE-/TK-/GP5+/M+/IL-18+、rPRV-gE-/TK-/GP5m+/IL-18+组中和抗体水平较高,最高达到3log2;rPRV-gE-/TK-/GP5m+、rPRV-gE-/TK-/IL-18+组未检测到抗PRRSV中和抗体。抗PRRSV特异性ELISA试验结果表明:试验组rPRV-gE-/TK-/GP5+/M+、rPRV-gE-/TK-/GP5+/M+/IL-18+、rPRV-gE-/TK-/GP5m+/IL-18+、rPRV-gE-/TK-/GP5m+抗PRRSV ELISA IgG抗体水平在第二次免疫后一周达到高峰并持续2-3周且ELISA IgG抗体水平无太大差异。相比而言,抗PRRSV ELISA IgA抗体水平则较低。抗PRV特异性中和抗体试验结果表明:PRV HB-98株商品疫苗组中和抗体达到4log2;rPRV-TK-/gE-试验组中和抗体达到5log2;rPRV-gE-/TK-/IL-18+试验组抗PRV中和抗体水平较高,中和抗体水平最高达6log2。该试验结果表明临床所分离到的PRV流行毒株基因缺失株rPRV-TK-/gE-可以产生较高的抗PRV流行毒中和抗体且IL-18可以有效增强机体的特异性体液免疫。通过T淋巴细胞细胞因子表达检测试验可知,共表达IL-18试验组CD4+、CD8+T淋巴细胞比例增多且细胞因子表达水平更高,引起机体体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫反应更强烈。本研究为研发通过黏膜免疫途径接种的预防PRRS和PR有效的重组活载体疫苗奠定了坚实基础。