造血干细胞移植(HSCT)是治愈许多难治性疾病的唯一方法。但供者免疫细胞识别宿主抗原所致的aGVHD直接影响HSCT的成功率。杀伤性细胞抑制性受体(KIR)是一组细胞表面糖蛋白，表达在NK细胞和部分T细胞表面，能特异性地与靶细胞表面MHCI类分子结合，传导抑制细胞毒活性的信号，正常情况下是维持自体免疫耐受的重要因素。小鼠的KIR为Ly49家族，属于CL-SF，配体是与之相对应的小鼠MHC(H-2系统)分子，Ly49A是Ly49家族中最早被发现的抑制性受体，与其结合的小鼠MHC-Ⅰ类分子是H-2d，在免疫识别阶段抑制杀伤性细胞早期活化。利用KIR对表达其配体的受者的特异性免疫耐受，定向增加供者某些的KIR表达，降低供者CTL活性，诱导免疫耐受而达到控制aGVHD的目的。 国内外末见造血干细胞移植中KIR~+T细胞与aGVHD发生及其调节的系统研究，本研究以小鼠aGVHD模型为基础，研究正常及同基因，基因半相合、异基因等移植类型中Ly49A~+T细胞在造血器官中分布异同及其动态变化，与GVHD发生的关系及其调控，并进行了调控后的体内实验。研究摘要报告如下： 目的：研究小鼠经典KIR Ly49A与aGVHD的关系；探讨用细胞因子D 中文摘要 体外调节 T淋巴细胞 Ly49A的表达，及提高移植物 T淋巴细胞中 Ly49A表达率对 aGVHD的发生的影响，推断通过诱导特定 KIR控制 aGVHD的可行性。 方洁：l构建 aGVHD模型清洁 级 BALB／C卜川、C57BL／6’《‘（B6）、 CB6F＊川“‘（BAL以cx C57BL／，CB6FI）小鼠，进行脾脏＿骨髓细胞混合 移植，建立小鼠aGVHD模型。实验动物分组：①同基因移植组B6一 B6或 BALB七—BALB止；②基因半相合移植组 B6—CB6F③异基因 移植组 B6—BALB七；④TBI对照组；⑤正常对照组。受鼠雌雄兼用， 于移植当大门）接受mC。Y射线致死性全身照射（TBI乃．SGylo．SGy， 4小时内尾静脉注射供鼠（雌性）细胞，（骨髓细胞 3 XIO勺脾细胞 3 xIO勺们．4＿1。根据需要于移植后不同时间活杀动物，取脾脏和骨髓 制备细胞，同时留取病理检测标本。动物死亡时 WBC＜1旷几，或 移植 15大后 WBC＄1．SX 10～L，为移植夫败。WBC＞l．SX 10’几并伴 有以下症状五种以上的定为GVHD：精神萎靡，翘毛，脱毛，皮损， 腹泻、弓背，眼炎，体重骤减甚至死亡；结合病理改变，d川 内出现 症状者为超急性GVHD；d川－d＋30出现者为 aGVHD。自移植开始每 大观察动物精神状态，发病情况、死亡时间，计算平均生存时间；小1 ～d＋60隔日在固定时间由尾静脉取血计数白细胞、血小板，并称量动物 体重。用 1％甲基纤维素半固体培养系统分别进行 CFU－GM、BFU上 和 CFU－MIX集落培养：计数 lffi股骨中去粘附后平均 MNC；分别加 入mGM－CSF、EPO＋IL－3、mGM－CSF＋EPO＋IL－3＋SCF，置于35mrn培 2 中文摘要 养皿，培养体系 lin／皿，每种集落平行培养三个皿。7叶 天后倒置显 微镜下观察计数集落数（CFU－GM＞40个细胞／集落；BFUE＞50个细 胞／集落，并呈多中心性；CFU－MIXIn 50个细胞／集落，两系以上集落并 存），实验数据以集落数／股骨记录。 2 Ly49A丫淋巴细胞的分布和动态变化及CSA对Ly49A表达的影响 CsA处理组：B6一CB6F；组动物由 do－d＋＊ 天以 CsA灌胃，l＊mg／0．4ml／ 只／天；CSA对照组，B6—CB6下 1组动物由 do～d＋刀天以生理盐水灌胃， 0．4ml／只／天；制备各组小鼠外周血、胸腺、脾脏及骨髓单个核细胞 （MN C人4℃PBS洗涤，锥虫蓝计数，拒染率＞95％；悬浮于5％FBS RPMJ 640培养液中，调整至所需细胞浓度。FCM分析各种移植模型 中外周血、胸腺 骨髓和脾脏 MNC Ly49A受体蛋白表达。抗体组合： ①Ly49A－PE（克隆号＊）；②mCD。e－FITC／Ly49A－PE：③mCD。－Biotin ／AvidinFITC／Ly49A－PE：④mCDs厂Biohn／AvidinFITCopgA－PE：⑤ NKI．IBiotin／AVidin－FITC／Ly49A－PE。Ly49A－PE采用同型抗体为对照 管，其它采用血清封闭的不染色细胞为对照。每管顺序加入细胞悬液 门 旷个细胞）和各种抗体，全部反应完毕后立即上机检测，获取 细胞数以000－15，00O，检坝及分析软件C＊＊L咖es1、Mn＊m。 3．细胞因子体外诱导T淋巴细胞Ly49A表达：制备小鼠脾脏单个核细 胞（MNC人 尼龙棉法分离 T淋巴细胞，以 FCM mCD3FITC测定 T 细胞纯度＞90％。细胞因子诱