莱氏野村菌(Nomuraea rileyi)是一种昆虫病原真菌,自然条件下可以侵染斜纹夜蛾等多种鳞翅目害虫,因此可以作为环境友好型的生物农药应用于害虫防治。真菌生物农药通常情况下以分生孢子作为有效活性成分,鉴于莱氏野村菌产孢条件苛刻,且在田间应用中易受温度、湿度、光照等多种环境因素制约,本实验室通过液体发酵诱导培养出微菌核,具有抗逆性强、货架期长、稳定性高、持续侵染等优点,可以取代分生孢子发挥侵染作用。因此,对莱氏野村菌抗逆功能的研究以及对微菌核形成的分子机理研究有助于改善其在生物防治中的应用前景。Rho GTPase是Ras超家族小G蛋白的最主要成员,作为分子开关控制细胞信号转导途径,在参与调控细胞极性生长和正常的形态建成中发挥重要作用。一方面,前人发现莱氏野村菌微菌核的形成与极性生长密切相关;另一方面,截止目前,在昆虫病原真菌中有关Rho基因家族的生物学功能研究尚未有过报道。鉴于此,本文以莱氏野村菌为研究对象,根据转录组信息,克隆目前仅发现的Rho1、Rho2、Rho3三个基因。通过国内外率先构建的根癌农杆菌介导的遗传转化体系,采用基因敲除的方式,对Rho基因家族进行功能研究,主要研究结果如下:(1)莱氏野村菌Rho家族基因的克隆与序列分析根据莱氏野村菌转录组文库Unigene序列,首次从莱氏野村菌CQNr01菌株中克隆得到3个Rho-GTPase家族基因,依次命名为Nr Rho1,Nr Rho2、Nr Rho3,登录号分别为KU948934、KU948935、KU948936。序列比对分析显示:Nr Rho1开放阅读框为807bp,编码268个氨基酸,含有2个内含子;Nr Rho2开放阅读框为603bp,编码200个氨基酸,含有3个内含子;Nr Rho3开放阅读框为651bp,编码216个氨基酸,含有4个内含子。生物信息学分析表明Nr Rho X(X=1,2,3,下同)蛋白分子量依次为29.9k Da、22.0k Da、23.7k Da;理论等电点分别为8.32、5.35、4.74;蛋白二级结构均主要以无规则卷曲为主要构象,均不具有跨膜结构域和信号肽;隶属于Ras超家族,存在Rho家族共同的保守结构域:GTP Mg2+结合位点、G1-G5 box、switch I和switch II区域。同源比对和系统进化分析表明,Rho X基因所编码的蛋白与13种真菌的Rho蛋白序列同源性在41.18%-96.13%之间,分别聚类到Rho GTPase家族3个独立的分支上,与昆虫病原真菌—罗伯茨绿僵菌的亲缘关系最近。(2)Rho家族基因敲除载体构建和缺失突变株筛选采用基于FPNI-PCR的染色体步移技术,成功克隆Rho X基因上下游1500-2000bp左右的未知序列。分别构建3个Rho单基因敲除载体Pzp-hph-Rho X,利用农杆菌介导的遗传转化体系在莱氏野村菌中分别实现Rho1、Rho2、Rho3单基因敲除,筛选得到3个基因的缺失突变株△rho1、△rho2、△rho3。(3)Rho缺失突变菌株表型分析缺失突变体表型分析结果表明:rho基因缺失对孢子形态无影响而会导致菌丝分支增多等异常形态。基础培养基中,缺失突变菌株前期生长缓慢,△rho1菌落边缘光滑,孢子呈酵母态,向菌丝态转换时间明显延迟。△rho2、△rho3产孢量相比于野生型显著降低48.93%、86.49%。抗逆性分析显示,Δrho1、Δrho2、Δrho3对刚果红和荧光增白剂的敏感性升高,两型转换时间推迟,菌落生长受到明显的抑制。除对SDS不敏感之外,在盐胁迫、渗透压胁迫、氧胁迫条件下,缺失突变菌株各自显示出不同程度的生长缺陷,产孢能力也表现出不同程度的下降。Rho基因缺失均未显著影响分生孢子对湿热胁迫的耐受力,紫外辐射处理分生孢子后△rho1萌发率降低,说明rho1缺失使得孢子对UV-B敏感性提高,rho2、rho3基因缺失使得分生孢子对UV-B辐射的耐受力无明显改善。△rho1、△rho3形成微菌核的时间延迟,微菌核部分颗粒变大且形态大小不均一、微菌核产量及生物量显著下降等。△rho2与野生型相比无显著性差异。上述结果表明,rho1和rho3对于微菌核形成是必要的,而rho2基因缺失不影响微菌核的形成。(4)莱氏野村菌rho基因表达模式分析采用实时荧光定量PCR对rho X基因表达模式进行分析表明3个基因在微菌核发育的不同时期均有表达,其中rho1在3.5d表达量最高,在5d时急剧下降,与此同时,rho2和rho3的表达量在5d达到最高,与1.5d相比,分别提高11.05倍6.47倍。因此,rho1在微菌核开始形成时期高量表达,而rho2和rho3则在微菌核成熟时期高量表达,表明rho X基因各自参与到微菌核发育过程的不同时期,具有时序性表达的特点。对缺失突变体进行表达模式分析表明,3.5d时,rho1缺失导致rho2表达量显著提高6.56倍,rho3缺失导致rho1表达量降低64.82%,与此同时,△rho2中,rho1和rho3的转录水平表达平稳,未呈现明显差异。在微菌核成熟时期(5d),rho1缺失后,rho2和rho3的转录水平表达平稳,△rho2中,rho1和rho3的转录水平无显著变化,而rho3缺失后,rho1表达量提高2.15倍。(5)缺失突变株致病性分析通过体表点滴和体内注射方式进行毒力测定,结果显示:rho1敲除突变株的半致死时间(LT50)分别为11.5d、10.06d,较野生型菌株显著延迟2.43d、1.9d,△rho2、△rho3与野生型无显著差异。上述结果表明:rho1缺失使菌株毒力显著降低,而rho2、rho3基因缺失不影响莱氏野村菌对斜纹夜蛾三龄幼虫的致病力。综上所述,通过基因敲除的方式,对Rho家族基因的生物学功能进行了研究,揭示了Rho1、Rho2、Rho3基因在调控产孢、萌发、形态发育、两型转换、抵抗逆境胁迫、微菌核形成、侵染致病等过程中各自发挥不同程度的作用。三个基因之间存在功能冗余现象,如Rho1缺失之后会刺激其他基因补偿性转录激活,一定程度上弥补其功能的缺失。以上结果体现了Rho基因家族之间既有功能多样性,又存在功能互补性,为昆虫病原真菌Rho基因家族的功能研究了提供科学依据,对Rho基因家族的交互功能分析及具体调控机制有待进一步研究探讨。