研究背景与目的登革病毒(Dengue virus, DEN)为黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)成员,含4个血清型(DEN-1、-2、-3和-4)。登革病毒为单股正链RNA病毒,共11kb,其基因组可分为两部分：5’端1／4的序列编码病毒的结构蛋白；3’端3／4的序列编码病毒的非结构蛋白,编码结构蛋白和非结构蛋白的基因顺序为：5’UTR-C-prM(M)-E-NS1-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5-UTR3’。登革病毒的感染已成为世界性卫生问题。登革病毒感染可引起登革热(Dengue fever, DF),登革出血热(Dengue hemorrhagic fever, DHF)以及登革休克综合征(Dengue shock syndrome, DSS),主要流行于热带与亚热带地区,每年约新增5亿感染病例,全球25亿人正面临着登革病毒的感染。它的传播媒介主要是埃及伊蚊和白纹伊蚊,目前,登革的预防主要通过切断蚊媒传播,尚无有效的疫苗用于预防。现今登革疫苗研究较有成效的有减毒活疫苗,嵌合病毒疫苗,重组亚单位疫苗,DNA疫苗等,但都存在安全性差,有效性不高的问题。研制登革疫苗困难的原因主要有：(1)登革病毒的致病机理尚不明确；(2)尚无合适的动物模型模拟DHF/DSS的发病过程；(3)研制的疫苗需对四个血清型的DEN感染均有保护作用,增加了疫苗研制的难度；(4)研制周期长,潜在的副作用限制等。现今,新型的多表位肽疫苗成为登革疫苗研究的新方向。自20世纪80年代Strohmaier等人发现口蹄疫病毒的146-154及200-213位氨基酸序列含有抗原性位点,从而找到了一种新型的疫苗,即表位疫苗。多表位肽疫苗具有安全性好、高度特异性、易保存和使用方便等优点。随着分子免疫学,分子生物学和生物工程信息学的发展,为病毒寻找抗原性表位提供了捷径。近年来表位肽疫苗已成为疫苗研究的热点。在抗病毒表位肽疫苗的研究中,现有HIV (Human immunodeficiency virus)、HCV(Hepatitis C virus)和HPV(Human papillomavirus)等多表位肽疫苗进入临床试验阶段。理想的多表位肽疫苗需免疫原性强,能诱导机体既产生体液免疫又产生细胞免疫应答。登革病毒的E蛋白(envelope glycoprotein)是公认的可引起机体产生保护性免疫的重要抗原蛋白,其含有可诱导机体产生中和抗体的抗原决定簇。E蛋白为糖蛋白,位于病毒表位构成病毒颗粒表面的突起,以同源二聚体的形式存在,它介导病毒和细胞受体的结合,使病毒进入细胞,发生感染。E蛋白单体可分为三个结构域(Domain):DⅠ、DⅡ和DⅢ。抗DⅡ和DⅢ的抗体都可以表现出中和病毒的作用,但抗DⅢ的抗体表现出极强的中和病毒作用,病毒型特异性更强。本研究以DEN-2 NGC株E蛋白的DⅢ为研究对象,应用生物信息学技术,通过网络生物信息学软件和DNAstar等软件对E蛋白和E蛋白的B、T细胞表位分析,认为DⅢ免疫原性强和特异性好,其中RHVLGRLITVNPIVT E345～359和EPGQLKLNWFKKGSS E383～397序列最有可能为T和B细胞表位。在亚单位疫苗的研究中,Consogno等在设计肿瘤多表位肽疫苗的研究中,预测杂合性T细胞表位,Th表位预测的一项重要成果是泛DR表位(pan-DR epitope, PADRE),它是一含13个氨基酸残基的人造通用型Th细胞表位,序列为AKFVAAWTLKAAA等。实验证明将PADRE与T表位或B细胞表位串联构建的多表位肽疫苗可以诱导高效的细胞或体液免疫应答,而且还发现PADRE对人体安全,无毒副作用。本研究将初步验证的登革病毒E蛋白结构域Ⅲ的T细胞表位(RHVLGRLITVNPIVT E345～359)和B细胞表位(EPGQLKLNWFKKGSS E383～397)连同PADRE串联成线性多表位肽结构,中间间隔GG氨基酸序列,用网络数据库对多表位肽进行分析,合成P1 (AKFVAAWTLKAAAGGRHVLGRLITVNPIVT GGEPGQLNWFKKGSS,纯度96.5%)线性多表位肽。同时合成一同行对照肽P2 (AKFVAAWTLKAAAGGKKSKAINVLGGIGESHFK GLVLI,纯度76.7%),其中P2序列中除PADRE序列与P1相同外,其他氨基酸序列为随意序列。将线性表位肽免疫C57BL／6j小鼠,观察其诱导体液、细胞免疫应答和保护性效应。研究方法1、多表位肽的生物信息学分析运用在线的网络服务器http://www. expasy. org/cgi-bin/protparam分析多表位肽P1的分子量、等电点和稳定性分析等情况。运用DNAstar软件分析多表位肽P1的α螺旋、β折叠、β转角和免疫原性所在区段。使用http://blast.ncbi.nlm.nih.gov的网络BLAST分析,观察多表位肽氨基酸序列的病毒型特异性。采用http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/的网络服务器预测多表位肽有无信号肽,及对信号肽切割位点进行分析。2、线性表位肽诱导的体液和细胞免疫应答SPF级4-6周龄雌性C57BL/6j小鼠共30只,随机分为P1组、P2组和PBS阴性对照组,每组共10只。每组相应免疫P1和P2,量100μg/只100μL, PBS阴性对照组免疫PBS缓冲液100μL,各免疫原与等体积的弗氏佐剂乳化后,腹部皮下多点注射,免疫三次,每次免疫间隔两周。分别于免疫前,免疫后第1、2和3次后两周(即免疫后2、4和6周)剪鼠尾采血,待其凝固后离心取血清,加入等量甘油冻纯于-20℃。经间接ELISA检测不同组别的小鼠于免疫后第2、4和6周的抗体滴度。每组随机抽取7份免疫血清标本,在2倍稀释梯度下测OD450nm吸光度A值,以免疫前小鼠血清作阴性对照组。以待测标本Dλ值／阴性对照Dλ值>2.1为阳性,出现阳性反应的最高稀释度作为该标本的滴度。用100TCID50 DEN-2 NGC感染将24孔板内Vero细胞,96小时后固定透化,Ⅲ分别加入不同免疫组别的多抗血清(P1、P2和PBS免疫后多抗血清、免疫前血清和兔抗登革病毒多抗血清)孵育过夜,洗涤后加入FITC-抗小鼠IgG或抗兔IgG,37℃孵育20min后洗涤,荧光显微镜下观察。同前法免疫小鼠,于末次免疫后两周分离小鼠脾淋巴细胞,以2.5×106个／mL的细胞溶度种于96孔细胞培养板,分别加入不同刺激原P1和P2各为25μg/mL,半适量PHA 5μg/mL, PBS 5μL/mL,完全培养基阴性对照组,同时设立空白对照组。孵育48小时后,加入CCK-8试剂,继续培养5小时后测OD450nm吸光度A值,以公式：刺激指数=(样本孔吸光值-空白孔吸光值)／(阴性对照孔吸光值-空白孔吸光值)×100%为准,计算刺激指数。按前法将小鼠免疫P1后,分离小鼠脾淋巴细胞种于96孔细胞培养板,加入不同的刺激原(P1和P2各25μg/mL, PBS5μL/mL,重复例数为4),孵育6小时后,按细胞因子染色试剂盒说明书操作方法对脾淋巴细胞进行细胞内因子染色,后上流式细胞仪检测。3、线性表位肽的保护性研究小鼠共20只,免疫法同前,分为P1、P2和PBS免疫组及空白组,每组共5只,腹腔注射感染DEN-2 NGC株2×109copies/只100μL,于感染后第1、3和5天剪鼠尾采血150μL, Trizol法提取全血总RNA,逆转录RNA为cDNA后,用绝对定量Real-time PCR法测定病毒载量。随机抽取不同免疫组别(P1、P2和PBS免疫组)末次免疫多抗血清3份,做2倍稀释梯度,从1：2至1：128,同时用完全培养基为阴性对照组。将100 TCID50病毒悬液与不同稀释度的实验血清等体积混合,37℃水浴孵育1小时后感染已铺种Vero细胞的96孔培养板内。孵育后弃病毒上清液,加入含4%FBS的DMEM完全培养基培养于5%CO237℃细胞培养箱内。每日显微镜下观察细胞病变,共观察7天,能抑制病变的50%的血清稀释度即为阳性。实验结果1、将PADRE和已分析得到的登革病毒特异性B细胞和T细胞表位串联,再次用网络数据库和DNAstar软件对其进行分析,该表位肽分子量较大(MW=4474.28),半衰期长(T50=4.4h),等电点为11.17。并且通过抗原性、特异性和信号肽分析,此表位肽具有免疫原性、型特异性和信号肽结构。2、线性表位肽P1免疫小鼠后,可诱导小鼠产生强的体液免疫反应,于免疫后第2、4和6周的抗体滴度为200±141.42,25600±18101,95085±19351,而P2对照组分别为8.57±3.78,62±46,814±589；PBS免疫小鼠后不能诱导体液免疫反应。经SPSS13.0重复测量方差分析(ANOVA for the repested measures)结果表明,不同组间IgG水平有显著的差异(F=109.75,P<0.001)；不同时间点检测的IgG水平有显著差异(F=86.75,P<0.001)；组别同时间之间有交互作用(不同组随时间变化,IgG变化不同,F=83.69,P<0.001)。以独立样本t检验(Independent-samples T test)对各时间点进行组间分析,免疫后2、4和6周,组间均有显著差异(P<0.05)。不仅如此,抗P1多抗血清可与感染DEN-2 NGC株的Vero细胞内的登革病毒结合,经FITC-抗小鼠IgG染色后,荧光显微镜下观察在Vero细胞浆内和胞膜上可见散在的极强的绿色荧光颗粒；而将对照组中不同来源的多抗血清用上述方法进行观察,只有兔抗登革病毒多抗血清组可见比P1多抗血清组更密集的绿色荧光颗粒,其它组别未见有绿色荧光颗粒。小鼠致敏脾淋巴细胞分离后体外培养,分别加入不同刺激原(P1、P2、PHA和PBS),观察不同刺激原对致敏淋巴细胞增殖的影响。小鼠的致敏脾淋巴细胞在受到致敏原的再刺激时,淋巴细胞发生了增殖。P1的刺激指数(stimulation index, SI, SI>1.1为阳性)为2.368±0.488；P2同时也含有PADRE表位,其淋巴细胞增殖中也检测到具有刺激效应,SI分别为1.656±0.31；亚适量PHA的SI为1.56±0.320；PBS刺激指数为0.862±0.075。经one-way ANOVA方差分析结果表明,不同刺激原刺激致敏脾淋巴细胞时,刺激指数有显著差异性(F=17.114,P<0.001)。P1多表位肽再次刺激致敏脾淋巴细胞时,刺激指数显著高于其他组别(P<0.005)。在细胞因子染色实验中,小鼠致敏脾淋巴细胞分离后体外培养,分别加入不同刺激原(P1、P2和PBS),采用FACScom软件散点图设门区CD3+和CD8-区分Th细胞(CD4+),最终以IFN-γ和IL-4散点图表示Thl和Th2细胞。P1组的Th1细胞比率为3.332±1.17,P2组的Th1细胞比率为0.685±0.262,PBS组的Th1细胞比率为0.6075±0.276。采用one-way ANOVA分析,由于方差不齐,故采用近似F检验Welch法,结果显示不同组间的Th1细胞比率有显著差异(F=9.207,P=0.018)。以Dunnett T3法进行组间多重比较,P1组的Th1细胞比率较P2组和PBS组高(P<0.05)。P1组的Th2细胞比率为1.13±0.747,P2组的Th2细胞比率0.47±0.253,PBS组的Th2细胞比率为0.48±0.344,同样采用近似F检验Welch法分析Th2细胞比率发现,各组间无差异性(F=1.282,P=0.35)。3、不同免疫组别(P1、P2和PBS组)和空白组的小鼠腹腔感染DEN-2 NGC后,Real-time PCR法检测小鼠外周血中的病毒载量,P1免疫组的小鼠仅于感染后第1天能测到低拷贝的病毒(3.8±2.674,单位103copies/mL),而后第3和5天均未检测到病毒。而P2、PBS免疫组和空白组小鼠感染病毒后,第1、3和5天病毒载量分别为5.22±1.888,75±24.595,2.86±0.952,(单位103 copies/mL);6.02±2.203,16.84±7.267,2.7±0.734,(单位103 copies/mL); 13.24±8.915,15898±7.601,33.38±20.28,(单位103 copies/mL)。重复测量方差分析(ANOVA for the repeated measures)结果显示不同组间的病毒载量有非常显著性差异(F=21.92,P<0.001)；不同时间点检查的病毒载量差异性也非常显著(F=22.02,P<0.001)；组别同时间之间有交互作用(不同组随时间变化,病毒载量变化不同,F=21.72,P<0.001)。以one-way ANOVA对时间点进行组间分析,感染后1、3和5天,组间具有显著性差异(P<0.05)。不同免疫组别的多抗血清倍比稀释后,等体积与100 TCID50 DEN-2 NGC株共孵育,再感染Vero细胞,每日观察见P1组多抗血清稀释1：64时可抑制50%的细胞病变,而其它对照组(P2和PBS多抗血清组)在任何稀释梯度下均未观察到抑制细胞病变的现象。结论1、生物信息学分析表明,表位肽P1具有型特异性、免疫原性和信号肽结构。2、P1为完全抗原,即有免疫原性又有反应原性。P1肽可诱导小鼠产生极高的抗体滴度,同时免疫后的双表位抗血清可与登革病毒结合。P1作为刺激原,可诱导脾淋巴细胞发转化,使Th0细胞向Th1细胞漂移,以增加CTL细胞效应。3、免疫P1的C57BL/6j小鼠可以产生中和DEN-2 NGC的抗体,当免疫小鼠感染DEN-2 NGC后,仅于感染后第一天可测到低拷贝的病毒。P1多表位肽可诱导小鼠产生保护性免疫效应。