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目的:胃癌是全球肿瘤相关死亡的主要因为之一,是我国常见的恶性肿瘤,占消化道肿瘤的50％～60％,严重危害着人类的健康,目前对胃癌的治疗仍是以手术为主,辅以放、化疗的综合治疗,虽然疗效较过去有了很大的改善,但总体效果仍不能令人满意。随着现代肿瘤免疫生物学和基因工程技术的迅速发展,肿瘤免疫治疗中树突状细胞的作用成为研究的热点。树突状细胞(dendritic cell,DC)是目前已知的功能最强的抗原呈提细胞(antigen-presenting cell,APC),参与抗原的捕捉、加工、处理和提呈,成熟的DC是唯一能激活幼稚T淋巴细胞(na(i)ve T cell)的抗原呈提细胞,在诱导高效而特异的抗肿瘤细胞免疫中起关键作用。
DC虽然广泛分布于机体所有组织器官中,但在外周血中含量极少,仅占单核细胞总数的0.1％-10％,分离纯化困难,不能满足基础研究和临床应用的需要,大量扩增高纯度DC是其研究的关键。为获得足够治疗量的树突状细胞,近年来,开展了体外多种不同前体细胞沿不同分化途径诱导扩增DC的研究,包括用人脐血、骨髓和粒细胞集落刺激因子动员后外周血中的造血干/祖细胞或单核细胞体外诱导扩增,已获得成功。由于树突状细胞主要来源于骨髓的CD34+造血干细胞,故从骨髓细胞中分离扩增诱导DC更易成功。本研究就小鼠骨髓树突状细胞(bone marrow-deftveddendritic cell,BMDC)制备的相关流程、添加GM-CSF、IL-4、TNF-α的剂量、时机、孵育时间等进行探究,探索、优化体外诱导和扩增小鼠树突状细胞的方法,通过形态学观察及流式细胞仪行相对特异性表面标志物检测以鉴定DC的成熟情况,摸索和印证DC体外培养和扩增的方法,提高DC的产量和纯度。
DC除了通过特异性肿瘤单克隆抗体(McAb)介导的细胞毒效应,增强杀伤肿瘤细胞的活性,激活并调控T淋巴细胞的免疫功能,对机体免疫反应发挥重要的调节作用外,还具有直接杀伤肿瘤的生物学活性。过去多采用同位素法、染料排斥法及乳酸脱氢酶(LDH)释放法等方法检测DC抗肿瘤细胞的活性,这些方法虽各具优点,但都存在一定的局限性,本研究采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法测定小鼠DC在不同孵育时间、不同效靶比(E:T)时对胃癌细胞的体外杀伤作用。探讨树突状细胞肿瘤免疫机制,为临床进一步研究与应用DC进行胃癌的免疫治疗提供佐证。
方法:
选取四周龄615小鼠,雌雄各半,处死,无菌条件下收集并纯化骨髓细胞,应用小鼠GM-CSF和小鼠IL-4诱导培养骨髓细胞,于第8天加入小鼠TNF-α培养24小时,倒置显微镜观察第1、3、5、7、8、10天DC的形态、大小、数量、分布及贴壁情况的变化。用流式细胞仪检测培养第7天、第10天DC表面标志物CD11c、DC86分子的表达。
将培养11天的树突状细胞悬液加入培养12小时的615小鼠胃癌细胞中,DC与胃癌细胞共孵育作为实验组,其效靶比分别为10:1、20:1、30:1；对照组分别单独加入胃癌细胞、DC和1640培养液。用MTT比色法分别测共孵育24小时、48小时的OD值,计算DC对胃癌细胞的杀伤活性。
数据统计应用SPSS13.0统计软件进行统计学分析,实验数据采用x2检验,p<0.05具有统计学意义。
结果:
1 DC的制备
每只615小鼠能分离出约3×107个骨髓细胞,培养第2天,相差显微镜下可见到培养板底部有半贴壁细胞,少量细胞集落形成,簇状生长,细胞体积小,圆形,细胞无明显突起,大量细胞贴壁生长,有细胞聚集现象。在细胞因子的刺激作用下这些细胞逐渐增殖,并且胞体逐渐增大,表面显示出不规则的突起,但贴壁能力相对下降,换液时轻微的吹打便可使其悬浮。培养第6天,较多细胞呈半悬浮生长,可见大量细胞集落形成,集落部分细胞表面出现毛刺样突起,并可见少量单个悬浮的典型DC。培养第7天,细胞集落变大,细胞体积增大,周边刺突明显,突起粗大、明显,细胞形态似星形或梭形。加入TNF-α48小时后绝大部分细胞悬浮,表面显示出明显的树枝状突起。经计数,1只小鼠的骨髓单个核细胞经诱导培养10d后DC的产量约为7×106。
2 DC标志物检测
分别收集加入TNF-α前及加入TNF-α48小时后的DC悬液,加入FITC anti-mouse CD11c、PE anti-mouse CD86单抗,避光孵育后,流式细胞仪检测各组DC表面CD11c、CD86的表达情况,将加入TNF-α前后组作为实验组,将未加抗体的DC作为对照组,结果显示,CD11c阳性表达率加入TNF-α前为:65.09±3.04％,加入TNF-α后为:70.99±1.44％(x2=6.625;p=0.097)；CD86阳性表达率加入TNF-α前为25.80±30％,加入TNF-α后为55.91±2.41％(x2=6.856；p=0.032),CD86阳性表达率加入TNF-α前较加入后高,二者比较差异有显著性(p<0.05),CD11c的阳性表达率加入TNF-α前后无差别(p>0.05)。
3 DC对胃癌细胞的杀伤活性检测
成熟DC与615小鼠胃癌细胞共孵育24小时,用MTT法检测DC在效靶比分别为10:1、20:1、30:1时对胃癌细胞的杀伤活性分别为:22.62±2.94％、45.75±1.48％、74.24±0.34％,三组之间比较DC对胃癌细胞的杀伤活性有显著性(x2=13.997；p=0.036),并随效靶比的增高而增高；共孵育48小时DC对胃癌细胞的杀伤活性分别为:28.32±3.27％、50.77±0.53％、79.90±2.65％,三组之间比较DC的杀伤活性有显著差别(x2=13.420；p=0.037)；共孵育24小时各组与48小时各等效靶比组间比较无差别。对照组中DC、胃癌细胞、1640培养液之间比较差异无显著性(p>0.05)。
结论:
1提取纯化小鼠骨髓细胞,经细胞因子GM-CSF、IL-4、TNF-α的刺激诱导产生的DC,经形态学观察及流式细胞仪表面标志物检测,证实数量较大、纯度较高,此方法稳定可靠。
2 MTT比色法测不同效靶比、不同孵育时间时树突状细胞对小鼠胃癌细胞的杀伤活性,成熟DC对胃癌细胞有较强的杀伤作用,其杀伤活性随效靶比的增大而增加,随共孵育时间的延长杀伤活性有增加的倾向,从而为今后胃癌的临床免疫治疗奠定基础。