论文部分内容阅读
自身免疫性疾病实验诊断的主要指标之一是自身抗体的检测<[3]>,血清中抗SSA/Ro、SSB/La抗体在临床诊断上有重要参考价值,在原发性干燥综合征(pSS)、系统性红斑狼疮(SLE)、亚急性皮肤型狼疮(SCLE)、新生儿狼疮(NLE)等病人的血清中阳性率较高<[4]>,它们在发病机制中的作用尚不清楚.目前,由于抗原来源和检测方法的限制,国内尚无ELISA方法检测ENA试剂盒问世,为了给开发该项目打基础,本研究利用基因工程技术,克隆了SSA/Ro、SSB/La基因,表达了Ro60KD重组蛋白,建立ELISA方法,检测了风湿病患者血清中抗60KD抗体,并进行了临床意义初步探讨.首先从Hela细胞提取总RNA,应用RT-PCR方法扩增cDNA,再以此为模板作PCR,将PCR产物与表达载体PET-30a酶切后进行连接,转化大肠杆菌DH5α,碱裂解法进行质粒小量制备,通过酶切鉴定和PCR扩增鉴定,并经测序证实为SSA/Ro52KD、60KD、SSB/La编码序列.表达载体构建成功后,在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中获得了高效表达,产生重组融合蛋白.利用金属螯合亲和层析法进行纯化,得到了高纯度的、具有Ro抗原活性的重组蛋白,达到ELISA检测要求,为制备重组抗原用于临床检测奠定了基础.以重组蛋白为抗原,建立ELISA方法,检测了临床标本336例,其中pSS124例、SLE104例、类风湿关节炎(RA)36例、系统性硬化症(SSc)20例、混合性结缔组织病(MCTD)12例、健康人40例,比较抗Ro60KD抗体在各组人群中的阳性率,探讨该抗体在pSS、SLE诊断中的价值.综上所述,本研究成功地克隆了SSA/Ro、SSB/La基因,表达并纯化了60KD重组蛋白,建立ELISA方法检测了风湿病患者血清中抗60KD抗体,为进一步探讨自身抗体与疾病的相关性、开展抗60KD抗体的临床检测、抗原表位的定位研究、小肽的筛选及蛋白功能的研究奠定了基础.