生物柴油是生物质能的一种形式,具有绿色、可再生、能耗低等优点,能够缓解石油即将枯竭和环境污染对人类造成的危机,成为国内外重点研究开发的热点。与传统的化学催化法相比,脂肪酶法合成生物柴油条件温和、工序简单、能耗低、绿色环保。但是由于脂肪酶成本高,有机溶剂对脂肪酶有毒性,脂肪酶具有催化特异性等因素的影响,使酶法生产生物柴油难以有较大的突破和产业化。本研究主要对耐有机溶剂脂肪酶产生菌腐生葡萄球菌M36脂肪酶基因lip3进行克隆,并在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中表达；还对lip5基因进行定点突变,以获得耐有机溶剂的重组脂肪酶。主要研究结果如下：1.腐生葡萄球菌M36脂肪酶基因的克隆。以腐生葡萄球菌M36为出发菌株,提取总DNA,采用PCR和Sitefinding-PCR的方法分别扩增出741 bp和804 bp的成熟肽基因片段,lip3和lip5, GenBank登录号分别为：FJ979867和FJ979868。2.Lip3基因在大肠杆菌中的表达及重组酶性质研究。将lip3基因与大肠杆菌胞内表达载体pET-DsbA连接,构建重组质粒pET-DsbA-lip3,转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。经过SDS-PAGE电泳、活性染色以及琼脂显色平板的检测证明了lip3的正确表达。优化诱导培养条件,结果表明：在pH8的LB培养基中培养至OD600为1.0时,加入IPTG至终浓度为0.4 mmol/L,25℃诱导培养12 h,重组酶活力最高达到25.8 U/mL。重组酶BL21/pET-DsbA-lip3通过Ni柱去除融合蛋白配体得到电泳纯的腐生葡萄球菌lip3脂肪酶蛋白,并研究重组酶的酶学性质。结果表明：重组酶BL21/pET-lip3最适反应pH为8.0,最适反应温度为25℃；对甲醇、正己烷和正庚烷等有机溶剂有较好的耐性；Mg2+和β-巯基乙醇对重组酶有一定的激活作用。3.Lip3基因在枯草芽孢杆菌中的表达及重组酶性质研究。将lip3基因与枯草芽孢杆菌载体pHT43连接,构建重组质粒pHT43-lip3,电击转化入枯草芽孢杆菌DB104内,实现了分泌型高效表达。对重组脂肪酶pHT43-lip3酶学性质进行研究,结果表明：重组酶的最适反应pH为8.0,最适反应温度为50℃；在乙醇、异丙醇、丙酮中保存1小时,酶活能保留50%以上,而异戊醇对脂肪酶的活力有提升作用；金属离子和表面活性剂中,Na+、K+和β-巯基乙醇对重组酶有一定的激活作用。4.Lip5基因的定点突变及在枯草芽孢杆菌中的表达。应用重叠延伸PCR的方法构建脂肪酶基因lip5的突变体lip5D93s,并连接枯草芽孢杆菌载体pHT43,在草芽孢杆菌DB104中进行分泌型表达。结果表明：lip5原始基因一级结构上保守的motif Gly-His-Asp-Met-Gly(91～95位),活性中心的Ser变成了Asp,确实是导致其表达没有活性的原因。对重组酶pHT43-lip5D93S勺酶学性质进行研究,结果表明：最适反应温度为40℃,最适反应pH为8.0,在异丙醇、正己烷、正庚烷、丙酮中保存1小时,酶活能保留50%以上。