论文部分内容阅读
【背景和目的】恶性肿瘤的发生发展涉及一系列复杂的分子过程。在癌变过程中，伴随有多种致癌基因的活化或突变以及抑癌基因的失活。Bcl10基因是一种从MALT淋巴瘤t(1;14)(p22;q32)染色体易位断裂点克隆出的与细胞凋亡调节有关的基因，由其编码的Bcl10蛋白广泛参与多种疾病的发生发展过程。Bcl10基因的突变或过表达与淋巴瘤的发生发展密切相关[1,2]。在多种实体瘤如卵巢癌、头颈鳞状细胞癌、肝细胞肝癌、宫颈癌、乳癌、肾透明细胞癌中研究发现，Bcl10广泛参与癌细胞的侵袭浸润，促进癌细胞生长[3-8]。研究表明，结直肠癌组织中Bcl10表达显著高于正常组织[9]，那么Bcl10的高表达是否也参与结直肠癌的生物学行为呢？本文拟通过慢病毒介导的Bcl10基因knockdown后对这一问题进行研究，并探讨可能的分子机制。【方法】利用磷酸钙共沉淀转染法包装含Bcl10基因shRNA的慢病毒颗粒,并用其感染HCT116细胞，puromycin选择性筛选，构建Bcl10基因稳定沉默的细胞株模型。利用RT-PCR和Western Blot检测Bcl10mRNA和蛋白表达水平，台盼蓝拒染法和噻唑蓝法(MTT)检测细胞生长情况，克隆形成实验观察细胞克隆形成能力。流式细胞术检测肿瘤细胞周期改变，体外迁移实验（Transwell小室）和划痕实验分析Bcl10基因knockdown后对HCT116细胞迁移能力的影响，Western Blot和EMSA技术检测相关信号通路分子的改变，探讨其可能的分子机制。【结果】将携带Bcl10shRNA的慢病毒颗粒感染HCT116，经puromycin筛选成功构建阴性对照组细胞HCT116/sh-eGFP、实验组细胞HCT116/shBcl10。经RT-PCR和Western Blot鉴定后，发现实验组Bcl10在基因和蛋白水平都被有效抑制。将该细胞模型用于后续研究，结果：（1）台盼蓝拒染法和噻唑蓝法(MTT)都表明，HCT116/shBcl10的生长受到明显抑制（P<0.05）。在克隆形成实验中也发现HCT116/shBcl10克隆形成能力下降（P<0.05）。流式细胞术测细胞周期显示，HCT116/shBcl10组细胞被阻滞在G2/M期。体外迁移实验证实，空白组HCT116和阴性对照组HCT116/sh-eGFP穿膜细胞数没有明显差异（P＞0.05），但HCT116/shBcl10穿膜细胞数与空白组和阴性对照组相比，差异有显著性意义（P<0.05），说明Bcl10基因knockdown后使HCT116细胞的迁移能力显著降低。（2）应用WB和EMSA技术检测相关信号通路分子的改变，结果发现Bcl10基因knockdown后，Pin1、MMP-7、MMP-9、Cdc25c、Cdc2P34、cyclinB1等分子的表达受到抑制，p-Cdc2P34(Thr14/Tyr15)的表达上调，而NF-κB和JNK分子未发生改变。【结论】应用慢病毒介导的RNAi技术成功构建了Bcl10基因knockdown的细胞株HCT116/shBcl10。Bcl10基因knockdown后并不影响NF-κB和JNK分子表达，但可使Pin1、MMP-7、MMP-9、Cdc2P34、cyclinB1、p-Cdc2P34(Thr14/Tyr15)等分子的表达受到抑制或上调，使HCT116细胞的细胞周期被阻滞在G2/M期，细胞生长延缓，克隆形成能力降低，细胞迁移能力受抑制。