论文部分内容阅读
黑色素瘤具有恶性程度高、生长迅速、预后差等特点,近年来其发病率和死亡率急剧上升,引起较广泛的社会关注。放射治疗是恶性肿瘤治疗的主要手段之一,也是晚期黑色素瘤的主要治疗方法,但治疗中常易出现放疗耐受性增加,直接影响黑色素瘤的治疗效果,如何降低黑色素瘤的放疗耐受并研究其可能存在的相关机制关系到患者的预后生存,对临床治疗意义重大。MicroRNA(miRNA)是一类广泛存在于真核生物长度约为22个核苷酸的小分子单链RNA,目前已知的miRNA最广泛的功能是通过其种子序列识别靶基因mRNA 3’-UTR上的结合位点,抑制其靶基因的表达。研究发现miRNA能调节人类近1/3的基因,miRNA的基因调控作用也是一个复杂的网络状结构,目前越来越多的研究表明miRNA与肿瘤的进展有着密切的关系,并且部分miRNA在肿瘤的放射治疗中也发挥重要作用。研究表明,miR-615-3p可影响多种肿瘤的发生发展,发挥抑制肿瘤的作用,但在黑色素瘤中的作用及其机制仍不清楚,并且其对黑色素瘤放疗疗效的影响尚未见报道。目的:研究miR-615-3p对黑色素瘤A375细胞生物行为的影响,发掘miR-615-3p发挥作用潜在的靶基因,以及miR-615-3p在黑色素瘤细胞放射治疗中发挥的作用及其相关的分子机制。方法:过表达或抑制黑色素瘤A375细胞内miR-615-3p的表达水平,CCK-8法及RTCA测定A375细胞增殖;划痕实验检测细胞迁移能力;检测细胞克隆集落形成;流式细胞术检测细胞周期。利用Starbase数据库预测miR-615-3p可能作用的靶基因,qRT-PCR及Western blotting法筛选并验证。将A375细胞稳定过表达或抑制miR-615-3p表达水平,48 h后给予5 Gy X射线辐射,RTCA实时监测细胞增殖,Western blotting法检测细胞内DNA损伤及凋亡相关蛋白的表达。结果:1.A375细胞内miR-615-3p过表达后,细胞增殖率降低,细胞迁移能力下降,克隆集落形成减少,细胞周期阻滞增加且主要发生于G1期;抑制细胞内miR-615-3p表达后,细胞增殖率及细胞迁移能力升高,克隆集落形成增加,细胞周期阻滞降低。2.对Starbase数据库预测结果进行验证,结果显示SPIN1蛋白与miR-615-3p可能存在作用关系,过表达miR-615-3p后,SPIN1的mRNA及蛋白表达水平明显降低,而抑制miR-615-3p则引起SPIN1的蛋白表达水平升高。3.过表达A375细胞内miR-615-3p水平并给予X射线辐射后,导致细胞增殖呈时间依赖性下降,DNA损伤相关蛋白γH2AX表达水平升高,凋亡相关蛋白Bax及caspase-3表达升高;抑制细胞内miR-615-3p水平并给予射线辐射后,细胞增殖升高,γH2AX、Bax及caspase-3蛋白表达水平均下降。结论:miR-615-3p可抑制黑色素瘤A375细胞的增殖、迁移、克隆形成,并导致细胞周期阻滞;SPIN1蛋白可能是miR-615-3p作用的潜在靶基因,miR-615-3p可经抑制SPIN1的表达影响细胞增殖;miR-615-3p对A375细胞具有辐射增敏作用,可促进辐射所致的细胞DNA损伤及凋亡发生。