核苷肽类抗生素尼可霉素和多氧霉素具有相似的化学结构,都是由核苷和肽基基团通过形成肽键缩合而成,它们的结构与负责真菌细胞壁合成的几丁质合成酶的天然底物UDP-N-乙酰葡萄糖胺类似,能够竞争性的抑制真菌细胞壁的几丁质合成,从而起到抑杀真菌的作用。本实验室前期工作通过组合生物合成,将可可链霉菌中多氧霉素肽基生物合成相关的5个基因,转入圈卷产色链霉菌尼可霉素肽基合成缺失突变株中,通过尼可霉素特有的核苷基团与多氧霉素所特有的肽基缩合,得到了具有新结构和理化性质改善的杂合抗生素polynik A,然而杂合抗生素在原产生菌中的产量较低,限制了进一步的开发研究。在组合生物合成及合成生物学发展的背景下,本研究工作一方面借助合成生物学手段,通过异源表达,进一步提高polynik A的生物合成产量；另一方面以polynik A的生物合成为研究对象,探索并解决合成生物学研究中经过理性设计的元件及功能模块在不同底盘细胞中表达的适配性问题。本研究首先通过计算机辅助设计,分别针对大肠杆菌和链霉菌底盘细胞,重新设计了polynik A生物合成基因簇的序列,对在不同底盘细胞中表达的基因密码子的使用、核糖体结合位点(RBS)及基因排布进行了优化设计,以分别适应在大肠杆菌和链霉菌底盘细胞中的表达。在构建适合大肠杆菌表达的polynik A生物合成基因簇中,为降低合成生物学适配性研究的复杂度,我们首先尝试了组装polynik A核苷基团(nikkomycin Cx)的合成模块,通过对优化密码子的基因进行了全合成,并借助实验室已建立起的敲入组装(knock-in assembly)方法,在前期已构建的含有sanO/P基因的大肠杆菌BW25113染色体上,继续将全合成的sanQ/R/F/A/B1/B2/C/D/X共9个基因依次敲入整合到BW25113菌株的染色体上,完成了无痕组装,并在T7启动子的控制下重新组成了sanO/P/Q/R/F/A/B1/B2/C/D/X转录单元,再通过敲入法,在该菌株染色体的sanO-X转录单元上游引入了由阿拉伯糖启动子控制的T7 RNA聚合酶基因(polT7);通过阿拉伯糖诱导表达T7 RNA聚合酶,指导T7启动子共转录并通过翻译偶联表达与polynik A核苷合成相关的11个功能基因。对得到的菌株通过发酵后进行了基因表达的测试,对发酵液的HPLC检测未获得目的产物(nikkomycinCx)峰,继续提取了发酵菌株的RNA,并以反转录PCR检测基因簇的转录情况,结果显示选择的7个基因都可检测到转录信号,说明T7启动子在转录水平可以使该基因簇进行共转录：通过液质联用高分辨质谱技术对实验菌株的可溶性蛋白及全蛋白样品进行了Trypsin酶解后的质谱检测,结果显示可溶性蛋白样品中可以检测到SanO/F/C/X蛋白的肽段,在全蛋白样品中可以检测到除SanR、SanBl外的其他9个蛋白的肽段,说明部分蛋白未能成功进行翻译,而部分蛋白的表达形成了包涵体,因此尚需对该表达体系的蛋白翻译环节进行进一步的优化。在构建用于链霉菌表达的polynik A生物合成基因簇时,我们选择了更简约的功能模块(合成nikkomycin Cz模块)进行了重构及表达测试,以链霉菌整合型质粒pIJ8660为载体,通过Gibson法克隆组装了含有sanF/A/Bl/B2/C/D/X/Y共8个基因表达质粒,并以链霉菌组成型高表达启动子PhrdB指导基因的表达,构建的表达质粒分别转入天蓝色链霉菌M145和M1146菌株进行基因表达和代谢产物检测。对重组菌株进行发酵后,首先通过HPLC对目的产物nikkomycin Cz进行了检测,结果并未获得目标差异峰；对重组菌株进行了RNA提取及反转录PCR检测,检测的5个基因中4个有转录信号,但最后一个基因san Y未检测到转录信号,说明该表达模块的构建在转录方面需要进一步优化。本研究工作通过合成生物学手段重新设计、优化并构建了在不同异源受体中生物合成polynik A中间组份的功能模块,进行了功能模块表达的初步测试,并获得了各功能元件表达的信息,为进一步对功能模块进行表达的优化奠定了基础。