肿瘤是严重危害人民生活和健康的重大疾病之一,尽管肿瘤治疗中常用的手术、放疗、化疗等手段逐渐有了很大的改进,先进治疗手段、治疗药物、治疗工具层出不穷,但据官方统计数字表明:肿瘤死亡率不断攀升(占城市人口死亡总数:21.8%,农村为16.5%),已代替心脑血管疾病,成为第一杀手,发病年龄亦趋于年青化。当前,治疗恶性肿瘤的方法仍然依赖常规的手术,放疗,化疗三大手段。然而,受制于疾病进展和患者本身健康状况的影响,并不能充分发挥三种疗法的治疗优势,例如失去手术机会或者无法耐受化疗放疗的副作用,患者与相应疗法较差的兼容性导致肿瘤的治愈率低,死亡率高,然而医生却一筹莫展,治疗手段枯竭。新兴的肿瘤生物治疗是对当前治疗手段的巨大补充。该疗法主要是通过调动和增强宿主自身的防御机制,改变宿主对肿瘤细胞的生物学应答而取得抗肿瘤效应。该方法主要包括细胞因子、免疫细胞、特异及非特异免疫制剂等多种治疗技术。与传统化学疗法和放射疗法相比,生物治疗具备毒副作用小、适用范围广等特色。而其中的细胞治疗克服了临床常规治疗的局限性,有效消除手术或化疗后残余的肿瘤细胞,进而防止肿瘤的复发和转移,因此,该疗法展示出广阔的应用前景。目前,在临床中采用的免疫细胞治疗策略主要有树突状细胞(Dendritic cell,DC)、CTL细胞、NK细胞与CIK细胞治疗。在上述治疗方法中,DC通过强大的递呈肿瘤抗原诱导机体特异性抗肿瘤免疫能力而成为肿瘤免疫治疗的中心。2010年5月,美国FDA批准了首个肿瘤生物治疗细胞疫苗—Provenge,由512名受试者参加的III期临床实验结果显示,患者采用Provenge治疗之后总体生存期比对照组延长4.1个月,这是肿瘤的免疫细胞治疗领域历史性的突破。该疫苗的成功上市极大地推动了生物治疗的发展。除此之外,其他国家如加拿大、澳大利亚、俄罗斯等,也批准了多种肿瘤治疗性疫苗用于临床治疗。当前包括树突状细胞(DC)在内的治疗性免疫细胞均来自肿瘤患者自体,即是完全“个体化”治疗。然而自体来源的DC细胞功能,数量均存在较大的差异性。尤其对荷瘤患者体内,肿瘤微环境对体内的免疫细胞存在确定的功能抑制。这既不利于自体免疫细胞疗效的充分发挥,也不利于严格的临床试验组间对照。这制约了DC肿瘤疫苗规范化制备和产品化生产。如何获取--尤其是从肿瘤患者体内--足量的功能完善的DC细胞,成了困惑研究人员的难题。由干细胞诱导生成各种治疗性组织细胞是当前的研究热点。干细胞诱导为DC细胞已经成为事实。通过构建特殊的培养体系,科学家从人多能干细胞包括人胚胎干细胞(Human embryonic stem cell,h ESCs)和人诱导多能干细胞(Human induced pluripotent stem cell,hi PSCs)成功诱导出DC,但数量和功能质量尚无法应用与临床。造血干细胞能够培养出DC细胞,且某些方法制备的DC数量大,功能强。脐带血富含造血干细胞,利用新鲜脐带血的造血干细胞大量制备DC细胞,规模化存储,将来实现商品化销售,是一件利国利民的好事。本实验旨在探索从脐带血CD34+造血干细胞大量诱导DC形成并通过体内外实验验证DC肿瘤疫苗抗肿瘤效应。利用先进的工艺尽量简化细胞培养过程中的操作步骤比如离心,换液,缩短细胞培养周期,降低细胞培养成本是我们所关心的问题。Lonza开发的新型细胞培养器皿就是解决这种关切的努力之一。我们的“DC工厂”同样需要创新的培养容器,虽然本部分实验并未在这方面有所创新,但这是“DC工厂”应用研究的下一个方向。第一部分脐带血CD34+造血干细胞诱导大量DC生成目的:从脐带血CD34+造血干细胞大量诱导制备DC细胞。方法:密度梯度离心法分离脐带血单状核细胞,CD34阳性磁珠分离CD34+造血干细胞并持续扩增30天。扩增期间DC细胞持续贴壁收获,置于液氮长期保存。显微镜对比CD34-DC和单核来源DC(PBMC-DC)的形态差异,流式细胞术检测两种细胞的表面分子表达水平差异,混合淋巴增殖实验确定两种细胞促T细胞增殖活性的差异,利用右旋糖酐吞噬实验验证冻存和未冻存的两种DC在培养过程中吞噬能力变化的差异。结果:1新鲜脐带血分离的CD34+造血干细胞经过30天的培养,总细胞量达到1010,而贴壁收获的DC细胞数量达到~109;2 CD34-DC细胞在由状态向成熟状态转变的过程中,形态上发生与PBMC-DC类似的变化:未成熟时突起较多,成熟后突起回缩,胞体变大,逐渐成悬浮状态;3 GM-CSF/IL-4培养基中培养的CD34-DC的表面分子CD83,HLA-DR,B7分子(CD80,CD86)表达水平较PBMC-DC高。PBMC-DC在未成熟态时CD80表达缺失,待成熟后表达升高;而CD34-DC在未成熟态时CD80逐步升高,成熟后与PBMC-DC的表达水平接近;4 CD34-DC与PBMC-DC有着类似的刺激T细胞增殖的能力;5 GM-CSF/IL-4培养冻存和未经冻存的CD34-DC和PBMC-DC,d1-d5天的吞噬能力均逐渐升高,而d7天吞噬能力均下降。但在d1,d3,d5,d7四个时间点,CD34-DC的吞噬能力均强于PBMC-DC。结论:脐带血CD34+造血干细胞能够扩增诱导成大量与PBMC-DC具有相似形态学特征的DC细胞。CD34-DC具有更高的表面分子表达水平。冻存和未冻存的CD34-DC相较PBMC-DC具有更强大的吞噬功能。第二部分CD34-DC是制备肿瘤疫苗的合格的原料细胞目的:进一步验证CD34-DC细胞制备的肿瘤疫苗体外诱导抗肿瘤免疫活性能力。方法:用TNF-α和cocktail(TNF-α,IL1β,IL-6,IFN-γ,poly I:C)两种方法刺激负载抗原后的CD34-DC和PBMC-DC细胞成熟(即成熟DC疫苗)。用Elissa法检测GM-CSF/IL-4培养的两种DC细胞在未成熟和成熟状态下IL-12p70,IL-10的分泌。用CD34-DC和PBMC-DC疫苗诱导相应的CTL,用Elissa法检测CTL IFN-γ的分泌能力。用流式细胞术检测成熟CD34-DC和PBMC-DC表面CCR-7受体的表达,同时用Transwell小室实验检测成熟CD34-DC和成熟PBMC-DC的迁移能力。用MTS法检测CD34-DC来源的和PBMC-DC来源的CTL对肿瘤靶细胞的细胞毒性。结果:1未成熟CD34-DC和PBMC-DC在GM-CSF/IL-4培养基中培养的d1,d3,d5天的IL-12p70分泌水平极低。TNF-α刺激后IL-12p70分泌稍有增多。Cocoktail刺激后IL-12p70的分泌水平大幅增加,且CD34-DC的分泌量远高于PBMC-DC;2 GM-CSF/IL-4培养基中培养的CD34-DC和PBMC-DC d1,d3,d5天的IL-10低水平分泌。TNF-α刺激后IL-10的分泌增长明显。Cocktail刺激后IL-10的分泌更大幅度增加。在这两种刺激方式下,CD34-DC的IL-10分泌量均高于对应的PBMC-DC;3成熟的PBMC-DC表面CCR-7受体的表达水平高于CD34-DC,且前者在Transwell迁移实验中有更多的细胞发生迁移;4 TNF-α刺激下,CD34-DC疫苗诱导的CTL相较PBMC-DC疫苗诱导的CTL具有更强的IFN-γ分泌能力,差异有统计学意义;但cocktail刺激下,CD34-DC疫苗诱导的CTL相较PBMC-DC疫苗诱导的CTL具有更高的IFN-γ分泌水平,但差异无统计学意义;5 TNF-α刺激下,CD34-DC疫苗诱导的CTL相较PBMC-DC疫苗诱导的CTL具有更强的细胞毒性,但cocktail刺激下,两者诱导的CTL细胞毒性未见显著差异。结论:未成熟CD34-DC和PBMC-DC IL-12p70和IL-10的分泌水平较低,促成熟因子cocktail相比TNF-α更能刺激两种来源DC IL-12p70和IL-10的分泌,CD34-DC两种因子的分泌水平更高;cocktail作用的CD34-DC疫苗和PBMC-DC疫苗所诱导的CTL具有类似的IFN-γ分泌能力和细胞毒性。第三部分在人源化NOD/SCID小鼠体内证实CD34-DC疫苗具有明显的抗肿瘤预防和治疗作用目的:进一步通过动物体内实验验证CD34-DC肿瘤疫苗所诱导的抗肿瘤免疫效应能否带来实际的肿瘤预防及治疗效益,并将其与PBMC-DC肿瘤疫苗对比以初步论证“DC工厂”未来临床使用前景。方法:1免疫重建验证。实验分组:①实验组(重建+DC疫苗),②对照组(重建+PBS)。NOD/SCID小鼠于d0行人淋巴细胞免疫重建,d7,d10给予DC疫苗接种(CD34-DC疫苗或PBMC-DC疫苗),d49天处死动物取脾脏淋巴细胞做T细胞亚型分析,取外周血做IFN-γ含量检测。对照组方法同实验组;2 CD34-DC疫苗预防作用验证。实验分组:实验组I(重建+PBMC-DC疫苗),II(重建+CD34-DC疫苗);阳性对照组I(重建+空PBMC-DC),II(重建+空CD34-DC),III(重建+PBS);阴性对照组(PBS+PBS)。以实验组为例,NOD/SCID小鼠d0行人淋巴细胞免疫重建,d7,d10 DC疫苗接种(CD34-DC疫苗或PBMC-DC疫苗),d13天左侧腋窝第一次肿瘤造模,d21天右侧腋窝第二次肿瘤造模,每四天记录肿瘤体积变化,d49天处死动物,取瘤体测瘤重;对照组方法同实验组;3 CD34-DC疫苗的治疗作用。实验分组:实验组I(重建+PBMC-DC疫苗),II(重建+CD34-DC疫苗);阳性对照组(重建+PBS);阴性对照组(PBS+PBS)。实验组继续分为一支疫苗和两支疫苗组。实验方法:d0天免疫重建并进行肿瘤造模,d8给予一支DC疫苗或d8、d11给予两支DC疫苗,每四天记录肿瘤体积变化,d49处死动物,取瘤体测瘤重。对照组方法同实验组。结果:1免疫重建效果评价。d49天处死动物后,动物脾脏人淋巴细胞亚型检测:实验组(PBMC-DC,CD34-DC)CD3+T淋巴细胞分别为32.67±6.11%,34.33±6.43%,对照组为25.33±7.09%。CD4+T淋巴细胞分别为31.67±4.73%,34.43±7.51%,对照组为16.67±4.04%。CD8+T淋巴细胞分别为20.22±1.51%,21.00±6.00%,对照组为17.67±5.03%。外周血IFN-γ检测发现,实验组CD34-DC分泌IFN-γ高于PBMC-DC和对照组;2CD34-DC疫苗的预防作用。实验组一次种瘤(左侧腋窝)至d49动物处死,不成瘤,而对照组均成瘤。阳性对照组I,II,III间肿瘤体积对比无统计学意义;阴性对照组瘤体体积显著大于阳性对照组。d8二次种瘤(右侧腋窝)至d49动物处死。实验组均延迟4天出瘤,且瘤体体积PBMC-DC和CD34-DC间比较无统计学差异。实验组明显小于阴性对照组,但实验组与阳性对照组无统计学差异;处死后瘤体重量实验组明显小于阴性对照组,可与阳性对照组相比无差异;3 CD34-DC疫苗的治疗作用。实验组CD34-DC疫苗两支的瘤体体积小于一支疫苗,PBMC-DC疫苗组类似。实验组瘤体体积均小于阳性对照组和阴性对照组。动物处死后瘤体重量:实验组两支疫苗瘤重小于一支疫苗瘤重,但均小于阳性和阴性对照组。结论:1 NOD/SCID小鼠人免疫重建后能较长时间维持人T淋巴细胞数量和活性。接种疫苗后能显著提高CD4+T细胞比例和IFN-γ分泌量;2CD34-DC疫苗与PBMC-DC疫苗预防性接种能够完全阻遏小鼠皮下成瘤;3 CD34-DC疫苗产生与PBMC-DC疫苗类似的抑制肿瘤生长的作用,且两支疫苗应用产生的抑制作用强于一支疫苗应用。