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Orange(Or)基因最早是从橙色花椰菜(Brassica oleracea var.botrytis)的橙色菜头突变体中克隆出来的。它能诱导植物细胞的白色体向有色体转化。它还能够促进主要粮食作物类胡萝卜素的积累从而提高其营养价值,具有一定的经济价值。烟草叶片表面含有很多的表皮毛,而腺毛的数量占了表皮毛总量的85%左右。腺毛是植物次生代谢物质重要的合成和贮藏器官。由于烟草能合成重要的萜类前体物质异戊烯基二磷酸(isopentenyl diphosphate,IPP)和二甲基丙烯基二磷酸(dimethylallyldiphosphate,DMAPP),所以将其作为萜类化合物代谢工程研究的模式植物。目前对Or基因功能的研究已经比较清楚,该蛋白调控一系列重要代谢过程,但对腺毛分子水平上的探索较少。本文利用腺毛特异启动子在本氏烟草(Nicotiana benthamiana)腺毛中 表达拟南芥(Arabidopsis thaliana)的 Or 基因(AtOr),观察其代谢产物的变化,来深入揭示Or的作用机理,具有较大的理论价值和较大的应用潜力。拟南芥OR蛋白的氨基酸含有一段预测的叶绿体转运肽序列,我们将全长的AtOR和去掉了预测的叶绿体转运肽的截短版本的AtOR构建到亚细胞定位载体上,做了亚细胞定位。亚细胞定位结果显示全场的AtOR定位于细胞的叶绿体中,而去掉了预测的叶绿体转运肽的截短版本的AtOR附着在叶绿体表面。从青蒿(Artemisia annua)的基因组中克隆了其关键酶青蒿醛Δ11(13)双键还原酶(artemisinic aldehyde Δ11(13)double bond reductase,DBR2)基因的启动子,其长度为1797 bp。将全长的AtOr及其去除信号肽的截短版本(AtOrΔcTP)接入该启动子后一起装入双元表达载体。通过叶盘法转基因技术获得过表19株过表全长AtOr和7株过表AtOrΔcTP的转基因烟草株系。转基因烟草的生长表型正常,转入基因没有对其生长产生抑制作用。通过PCR扩增来检测阳性植株,从野生型的烟草植株中不能扩增出相应地基因条带,而从转基因的烟草中能扩增到符合大小的条带,表明目的基因成功转入到烟草植株中。实时荧光定量PCR对阳性植株进行鉴定,在不同的AtOr过表达株系中,AtOr的转录水平分别是烟草自身Or同源基因(NbOr)的37.21-254.45倍;而在AtOrΔcTP-1到7的过表达植株中,AtOrΔcTP的转录水平达到野生型的34.63-143.78倍。本研究利用冻刷法刷下T2代转基因烟草的腺毛,提取其RNA后进行反转录成cDNA再进行荧光定量PCR,结果显示AtOr-5-1到AtOr-8-3目的基因转录水平分别是野生型的1.86-15.30倍,AtOrΔcTP-1-1到AtOrΔcTP-2-3腺毛中的目的基因转录水平分别是野生型的0.91-2.62倍。扫描电镜对烟草表面的腺毛形态、类型等进行观察,未发现明显差异。实时荧光定量PCR检测其类胡萝卜素代谢途径上相关基因的转录水平,发现烟草牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶(geranylgeranyl diphosphate synthase,GGPPS)基因的转录水平上调。AtOr-5,AtOr-8、AtOrΔcTP-1、AtOrΔcTP-2的GGPPS转录水平分别是野生型的3.72倍、20.17倍、5.56倍、7.58倍。提取野生型和转基因烟草的色素进行分析,转基因烟草中的叶绿素和类胡萝卜素的含量有一定的上升。AtOr-5和AtOr-8的β-胡萝卜素的含量比野生型分别提高49.32%、12.00%。AtOr-5和AtOr-8的叶绿素a含量分别比野生型提高57.07%、6.60%。AtOr-5和AtOr-8的叶绿素b含量分别比野生型提高82.67%和20.01%。本论文的研究工作表明,带有信号肽的全长AtOR蛋白引起能够导入叶绿体,而促进了转基因烟草叶片中的类胡萝卜素合成。同时,我们的研究还表明,虽然青蒿素的生物合成发生于腺毛中,但其DBR2基因启动子在叶片中的作用更为明显。具体作用机制还有待于进一步研究。