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目的:应用高通量全转录组测序技术分析小鼠创伤性脑损伤(Traumatic Brain Injury,TBI)后脑细胞间隙外泌体中长非编码RNA(lncRNA)表达的变化。运用生物信息学方法分析差异性表达lncRNA,并构建lncRNA-miRNA-mRNA网络,阐明脑细胞间隙外泌体携带的lncRNA是如何调控TBI发生发展的,为TBI临床诊断提供新的分子标记物及为TBI的治疗提供新策略。方法:(1)建立外泌体分离方法:采用木瓜蛋白酶消化法结合外泌体分离试剂盒分离小鼠脑细胞间隙外泌体,用磷钨酸负染法利用透射电镜观察外泌体外观,Western Blot鉴定外泌体标志性蛋白CD63、TSG101和HSP70。(2)分组:24只C57BL/6小鼠随机分为TBI组和Sham组。(3)RNA高通量测序:提取总RNA,质控;去除核糖体RNA(rRNA),构建RNA文库并进行文库质控;全转录组测序,对lncRNA、miRNA和mRNA进行检测、鉴定及注释;对差异表达的lncRNA、miRNA和mRNA进行筛选。(4)验证RNA高通量测序结果:随机选择5个差异表达的lncRNA、miRNA和mRNA,并用实时定量PCR(qRT-PCR)法验证RNA高通量测序结果的准确性。(5)差异表达lncRNA生物信息学分析:根据差异表达的lncRNA相关基因进行基因本体论(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)信号通路分析。(6)选择相关基因,构建lncRNA-miRNA-mRNA相互作用网络。结果:(1)本研究成功建立了木瓜蛋白酶消化法和外泌体分离试剂盒相结合的方法分离小鼠脑细胞间隙外泌体。透射电子显微镜观察显示,外泌体为杯状,粒径在30~100nm的囊泡样膜结构。外泌体样本高表达外泌体特异性标志物CD63、TSG101和HSP70。(2)聚类分析显示,样品生物学重复情况良好,样品TBI组、Sham分组情况良好。与正常小鼠脑组织细胞间隙外泌体相比,小鼠TBI后脑组织细胞间隙外泌体中442个lncRNA的表达具有显著性差异(Fold change≥2,P-value<0.05),其中255个lncRNA差异性上调,187个lncRNA差异性下调;50个miRNA的表达具有显著性差异(Fold change≥1.5,P-value<0.05),其中5个差异性上调,45个差异性下调;1496个mRNA的表达具有显著性差异(Fold change≥1.5,P-value<0.05),其中118个差异性上调,1378个差异性下调。(3)GO分析显示,差异表达的lncRNA可能参与细胞定位、认知和学习或记忆,且与细胞核和细胞器的组成密切相关,并参与蛋白、氧和激酶等物质的结合过程。可见lncRNA对脑损伤后的神经元的修复以及机体的预后和学习能力的恢复相关。差异表达lncRNA参与的相关度最高的信号途径为MAPK和ARVC信号通路。(4)在lncRNA-miRNA-mRNA网络中,ENSMUST00000147847与mRNA Npas4和miRNA mmu-miR-200a-3p具有紧密联系,AK016241与mRNA Bdnf及miRNA mmu-miR-200a-3p具有紧密联系。ENSMUST00000152569可通过miRNA mmu-miR-30b-3p与mRNA Emp1和Rhobtb2产生相互作用。RNA错综复杂的网络关系对研究lncRNA在TBI的作用及其通过与miRNA和mRNA之间的相互作用发挥调控抑制性突触的形成和维持、神经元的存活以及细胞凋亡等作用提供了新的研究思路和切入点。结论:(1)TBI后外伤性脑组织可以将外泌体释放到脑细胞间隙,外泌体中生物分子的变化可以反映TBI后的生理和病理过程。(2)本研究报道并注释了一系列TBI后脑细胞间隙外泌体中差异表达的lncRNA,拓宽了TBI后脑细胞间隙外泌体内基因相关的研究思路,为进一步研究TBI分子机制和早期诊断及干预治疗提供了新的靶点,为外泌体及其内含物在TBI病情进展的作用机制提供了研究基础。(3)TBI后脑细胞间隙外泌体中的lncRNA表达具有差异性,差异表达的lncRNA参与TBI后特定的生物过程,通过lncRNA-miRNA-mRNA网络,参与TBI后的病理生理调控过程,进而参与TBI后损伤修复过程。