广义上讲,调节小RNA(small regulatory RNAs,以下简称“小RNA”)是指能调节基因表达或蛋白活性的所有细菌RNA分子,编码位置可为基因间区、m RNA反义链或5’或3’非翻译区(UTR),长度通常在50-500nt之间,靶分子可以是m RNA或蛋白质。由于其多数不翻译成蛋白质,转录后即可发挥调节作用,与蛋白类调节子相比,s RNA存在长度和反应时间上的优势,一旦合成或降解,迅速发挥或终止调节作用,属于细菌的一种节能调控方式。小RNA通常在与特定靶标m RNA的核糖体结合位点或其附近序列结合,干扰核糖体行为或影响m RNA稳定性,或与蛋白质直接结合,影响蛋白质活性,在转录后和翻译水平发挥调节作用,可参与细菌多种生理过程如生物膜形成、应激反应、致病等。根据与靶分子的位置关系和作用方式,分为順式和反式作用两种类型小RNA。反式作用小RNA半数以上需要RNA结合蛋白Hfq的辅助才能发挥作用。鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis,以下简称鼠疫菌)为革兰氏阴性菌,是一种自然疫源性疾病的病原菌,引发宿主高致死性疾病——鼠疫。鼠疫菌通常只在动物间传播,引起动物间鼠疫的流行,啮齿类动物是鼠疫耶尔森氏菌的贮存宿主,鼠蚤是其主要传播媒介。然而,人类偶然感染鼠疫菌通常是被感染的跳蚤叮咬或是直接与患畜接触而引起的,临床上常见的鼠疫有三种类型:腺鼠疫、肺鼠疫和败血症型鼠疫。鼠疫菌能够在鼠蚤前胃中形成生物膜是鼠疫菌能够在鼠蚤体内生存并且在宿主间传播的重要原因,也是鼠疫菌能够从假结核耶尔森氏菌进化而来的关键。调节蛋白参与的鼠疫菌生物膜形成的调控机制方面,目前已经取得了诸多进展。前期研究结果提示,鼠疫菌的小RNA很可能参与鼠疫菌的生物膜调控与致病。然而,单个小RNA是否和如何参与鼠疫菌中生物膜形成的调控有待更多的研究。本实验室前期研究发现:小RNA Hms A是一个鼠疫菌p PCP1质粒编码的高丰度小RNA。p PCP1质粒是鼠疫菌在进化过程中外源获得的一个质粒,该质粒对鼠疫菌生物膜形成和毒力的获得可能发挥重要作用。本研究旨在探究小RNA Hms A对鼠疫菌生物膜形成和毒力的影响及其可能的机制。依据鼠疫菌转录组测序结果,小RNA Hms A位于鼠疫菌p PCP1质粒基因组的9435-9500位碱基上,本研究首先通过Northern blotting实验验证了小RNA Hms A的存在、大小,并使用引物延伸方法确定了Hms A的精确转录起始位点。利用同样的方法比较了鼠疫菌野生型菌株(WT)和?hfq突变株中的Hms A丰度差异,证实了Hms A的Hfq依赖性。通过Northern blotting实验的方法比较了鼠疫菌WT和crp突变株中的Hms A丰度差异,证明了CRP调节蛋白能调控Hms A的表达。使用λ-Red同源重组方法构建小RNA Hms A的缺失突变株(?hms A),并测定了鼠疫菌的野生型菌株(WT)与?hms A的生长曲线没有明显差异,提示小RNA Hms A不影响鼠疫菌的生长。在此基础上,将小RNA Hms A的过表达质粒(p BAD-Hms A)导入到?hms A中,构建过表达菌株(?hms A:Hms A)。通过Northern blotting实验,验证Hms A在鼠疫菌WT、?hms A以及诱导和未诱导?hms A:Hms A菌株中的表达量。结果证实了诱导后的?hms A:Hms A菌株中Hms A的表达量显著高于其他菌株。为探究Hms A是否在鼠疫菌生物膜形成的调控中发挥作用,我们通过三种经典的生物膜形成检测方法(褶皱、结晶紫和线虫实验),比较鼠疫菌WT、?hms A和?hms A:Hms A的生物膜形成能力。鼠疫菌菌落表面褶皱实验观察并比较不同菌株在固体培养基上生长时菌落表面的褶皱形成情况,结果表明WT和阿拉伯糖诱导的?hms A:Hms A菌株菌落表面褶皱形成明显强于?hms A;结晶紫染色实验对不同菌株菌膜形成进行定量分析,结果表明WT和?hms A:Hms A菌株菌膜量明显高于?hms A;而线虫虫卵发育实验比较了不同菌株在线虫体内形成栓塞致虫卵的发育能力,结果表明WT和?hms A:Hms A菌株在线虫体内栓塞形成能力明显强于?hms A。此外,我们还测定了不同菌株中胞内c-di-GMP的浓度,结果表明WT和?hms A:Hms A菌株中c-di-GMP的浓度明显高于?hms A。以上实验证明了小RNA Hms A能够促进鼠疫菌生物膜的形成及c-di-GMP的合成。以上结果均提示,Hms A可能促进鼠疫菌生物膜的形成。此外,我们还利用小鼠攻毒实验分析了Hms A对鼠疫菌毒力的影响。将鼠疫菌的WT和?hms A菌株分别以静脉、腹腔和皮下注射的途径感染小鼠并计算小鼠的生存曲线,三种感染途径的攻毒实验结果都显示,感染?hms A的小鼠死亡时间略早于WT感染小鼠,表明?hms A菌株的毒力强于WT菌株,提示小RNA Hms A可能抑制鼠疫菌的毒力。上述实验已经证实,小RNA Hms A促进鼠疫菌生物膜的形成,并抑制鼠疫菌的毒力。为了进一步探究其可能的分子机制,我们采用了引物延伸、Northern blotting、q RT-PCR和β-半乳糖苷酶报告基因融合(Lac Z)等实验,检测了野生株和Δhms A突变株Hms A对生物膜相关基因或操纵子(hms HFRS、hms CDE、hms T、hms P、小RNA Hms B)和毒力相关基因或操纵子(psa ABC、psa EF、fur、rov A、rov M基因)的丰度或转录活性变化。实验结果显示,缺失了hms A后,hms HFRS操纵子、rov M基因和小RNA Hms B的转录活性和丰度下降,提示Hms A可以通过间接作用正调控这些基因的表达。半衰期的测定实验结果提示Hms A可能影响小RNA Hms B的稳定性。类似地,Hms A可能间接在转录水平上负调控rov A基因和psa ABC、psa EF操纵子,但不调控hms P和fur基因。然而,hms A的缺失引起hms T和hms CDE转录水平的下降,并不影响的其转录活性,推测Hms A对hms T和hms CDE的调控可能发生在转录后水平上。考虑到小RNA的调控多数发生在转录后水平上,通过上述实验初步筛选小RNA Hms A直接作用的候选靶标。为了验证小RNA Hms A的直接靶标基因,我们引入了低拷贝的gfp报告基因融合载体(p XG-10-SF),该翻译融合载体在大肠杆菌中已被较好的用来筛选和验证小RNA的直接靶标基因。于是我们选择了经典的s RNA-靶基因m RNA对—Mic F-omp F,来验证该系统在鼠疫菌中的应用,并进一步筛选小RNA Hms A的直接靶标基因。结果发现,鼠疫菌中过表达的小RNA Mic F能调节omp F基因报告基因融合载体上GFP荧光蛋白的表达,提示该报告系统能用于指示s RNAs介导的m RNA调节。然而,鼠疫菌野生株中Mic F正调节调节omp F,与大肠杆菌中负调节的结果相反。当鼠疫菌4个固有质粒缺失后,调节方向恢复,提示鼠疫菌中自身质粒影响小RNA Mic F介导的对omp F基因的转录后调控。我们最终证实了鼠疫菌的p PCP1质粒可能是影响小RNA Mic F介导的对omp F基因的转录后抑制的主要因素。因此,我们以Mic F-omp F为模型,建立了基于gfp报告基因融合载体的鼠疫菌中小RNA直接靶标基因筛选系统,但是在我们研究小RNA介导的基因调控时需要考虑鼠疫菌自身质粒的影响。随后我们通过gfp报告基因融合载体实验对小RNA Hms A的多个靶标基因(hms HFRS、hms CDE、hms T、hms P、fur、psa ABC、psa EF、rov A、rov M基因)进行了筛选,最终实验结果显示,Hms A过表达与否影响到hms T的翻译水平,提示hms T基因可能是小RNA Hms A的直接靶标基因,具体的结合机制还有待于进一步探讨。总之,这是首次尝试研究鼠疫菌外源获得质粒上的小RNA对鼠疫菌生物膜形成和致病的影响。本研究的实验结果证实:p PCP1质粒编码的小RNA Hms A促进鼠疫菌生物膜形成的同时,能够抑制鼠疫菌的毒力,提示小RNA Hms A可能在鼠疫菌由假结核耶尔森氏菌进化获得生物膜形成能力和毒力的过程中发挥一定的作用。我们筛选了Hms A可能调节的生物膜或毒力相关基因,有助于加深我们对小RNA参与鼠疫菌生物膜形成和毒力调节网络中的认识。然而,小RNA Hms A通过哪些关键的直接靶标基因调控,还需要更多实验来证明。此外,鼠疫菌的p PCP1质粒能够影响小RNA介导的靶基因的转录后调节,提示我们在研究鼠疫菌小RNA介导的基因调控时需要考虑鼠疫菌自身质粒的影响。