大口黑鲈是我国淡水养殖鱼类中养殖规模发展最迅速的品种之一,具有生长快、肉质鲜美和无肌间刺等优点,受到广大消费者的欢迎。随着养殖规模、密度和苗种流通的不断扩大,多种疾病在养殖大口黑鲈中频发,涵盖了病毒性疾病、细菌性疾病和寄生虫病,其中大口黑鲈蛙虹彩病毒（Largemouth bass virus,LMBV）是最为主要的病毒性疾病病原之一。感染LMBV而发病的大口黑鲈,典型的症状表现为体表局部溃疡,肝脾肿大,肝脏发白发黄。目前,针对LMBV引起的疾病还没有有效的药物,现阶段主要以提前预防或切断病原传播途径为主。本论文通过研制安全高效低成本的大口黑鲈蛙虹彩病毒病灭活疫苗,疫苗经腹腔注射免疫的方式,在一定剂量范围内能够获得较好的免疫保护效果,有效降低LMBV对大口黑鲈的致死率,为后续疫苗研发应用奠定基础。全文内容主要分为以下四个部分:1.基于LMBV的主要衣壳蛋白（MCP）基因设计特异性引物及Taq Man探针,通过反应条件的优化,建立了一种LMBV的Taq Man荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法以p MD-LMBV-MCP重组质粒为标准品,建立的标准曲线在4.6×10~2拷贝/μL～4.6×10~8拷贝/μL浓度范围内有良好的线性关系,相关系数（R~2）为1,扩增效率（E）为99.2%。利用该方法对30份临床样品进行检测,结果显示LMBV阳性率为40%,显著高于常规PCR的13.3%;建立的Taq Man荧光定量PCR检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于临床LMBV的检测和流行病学调查,为LMBV的早期诊断提供可靠的检测方法。2.从鳜鱼脊髓组织中建立了一个连续细胞系,并用于研究对大口黑鲈蛙虹彩病毒的敏感性。该细胞系命名为SCC,已经传代培养了40代。SCC细胞在添加20%胎牛血清的L-15培养基中,28℃培养可以观察到最佳生长。核型分析表明,第36代SCC细胞正常二倍体染色体数目为48。16S r RNA和COI基因部分扩增和测序证实了SCC细胞系来源于鳜鱼。SCC细胞接种LMBV之后出现典型的病变,感染第7天的病变细胞上清液的病毒滴度是1010TCID50/m L,LMBV可以在SCC细胞上稳定传代。通过对病变细胞的电镜观察,可见大量直径为132nm～174nm的病毒颗粒。3.通过进行LMBV敏感性实验,筛选出EPC对LMBV较为敏感,在病变时间和病毒载量都要比其它3种细胞有优势,可以用作LMBV的扩大培养。利用EPC,优化LMBV最佳的细胞培养方法,测试接种剂量、孵育时间和培养温度。结果显示,1:10稀释比例的病毒接种细胞,病变效果最好,病毒载量高;孵育50min之后的病变效果最好,病毒载量最高;LMBV在24℃培养病变效果最好,病毒载量最高。为了制备免疫效果较好的疫苗,对灭活条件、疫苗佐剂和免疫剂量进行了优化,最终选择了最佳灭活条件浓度是1mol/L BEI按病毒原液体积2%加入,温度37℃,时间48h;最佳免疫剂量是1312佐剂10~9 TCID50/ml。4.通过检测免疫相关基因的表达量、免疫酶活性和抗体水平的变化,以及免疫保护率来评价大口黑鲈蛙虹彩病毒细胞灭活疫苗,首先采用荧光定量的方法检测了免疫后鲈鱼脾脏中CD8-α、MHCI-α、Ig M、TNF-α、IL-8、IL-1β的表达量变化,通过检测结果发现,免疫后不同时间,六个免疫基因均不同程度的表现出先上升后下降的趋势。T-AOC,SOD,ACP和AKP的酶活性结果显示,T-AOC的实验组与对照组相比,酶活性基本没有什么显著变化。SOD,ACP和AKP在不同时间,免疫组中酶活性基本保持先增加后减少。ELISA结果显示,与对照组相比,不同剂量的疫苗在不同时间抗体水平显著增加,并且免疫剂量越高,抗体水平越高。大口黑鲈蛙虹彩病毒病灭活疫苗免疫后的鲈鱼进行攻毒,结果显示免疫后的鲈鱼死亡率明显低于对照组,说明研制的灭活疫苗有较好的免疫效果。本研究基于分离的大口黑鲈虹彩毒,采用灭活方法制备的灭活疫苗。免疫鲈鱼后,采用不同的免疫指标,分别对其免疫效果进行评价,发现具有较好的免疫保护,免疫保护率最高为88.9%,表明这个疫苗具有开发价值和应用前景。