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微孢子虫是一类专性细胞内寄生的单细胞真核生物,寄主广泛,能感染几乎所有无脊椎动物和脊椎动物,乃至人类。家蚕微粒子虫是最早被鉴定的微孢子虫之一;作为家蚕最主要的病害,它对世界蚕丝行业造成了巨大的经济损失。因此,检测与防控家蚕微粒子虫对蚕业生产具有重要意义。微孢子虫具有一个非常特殊的极管构造,它是微孢子虫特有的侵染结构,由多种极管蛋白组成;极管不溶于SDS、1%Triton X-100、1-10%H2O2和三氯甲烷等,可溶于β-巯基乙醇、DTT等还原剂,其独特的溶解特性与极管上蛋白组分特性密切相关。迄今微孢子虫极管蛋白在侵染中的作用机制尚不明确。本研究以家蚕微粒子虫假定极管蛋白4（NbPTP4）和假定极管蛋白5（NbPTP5）作为研究对象,对其定位特征、宿主互作靶蛋白的筛选及其在侵染中的作用进行分析,为阐明微孢子虫侵染宿主的分子机制奠定基础。本研究首先对NbPTP4和NbPTP5的序列进行了生物信息学分析,并通过重组融合蛋白的原核表达与纯化、多克隆抗体制备,进行了免疫荧光定位分析;然后利用免疫共沉淀的方法对NbPTP4与宿主互作靶蛋白进行了筛选,最后对NbPTP4与其互作靶蛋白在微孢子虫侵染过程中的作用进行研究。主要结果为以下四个方面:1.家蚕微粒子虫NbPTP4和NbPTP5的生物信息学分析通过与海伦微孢子（E.hellem）、兔脑炎微孢子虫（E.cuniculi）PTP4和PTP5的同源序列比对,成功获得了两个编码家蚕微粒子虫假定极管蛋白NbPTP4和NbPTP5的基因NbPTP4和NbPTP5。生物信息学分析发现:NbPTP4编码222个氨基酸,预测分子质量25.3 kDa、pI 7.56,无信号肽,不存在任何已知功能域;NbPTP5编码271个氨基酸,预测分子质量32.5 kDa、pI 8.68,无信号肽,无已知功能域。此外,NbPTP4中含有5个半胱氨酸,其中4个位点在其他种属微孢子虫PTP4中高度保守,NbPTP5中含有11个半胱氨酸,推测半胱氨酸可通过形成分子间或分子内二硫键在极管蛋白之间的相互作用中发挥重要作用。2.NbPTP4和NbPTP5的定位特征分析以家蚕微粒子虫基因组为模板,成功构建了pET-32a（+）-NbPTP4和pET-32a（+）-NbPTP5原核表达载体,分别制备相应蛋白的多克隆抗体。Western blot结果表明,制备的抗体可以与原核表达的NbPTP4、NbPTP5及家蚕微粒子虫孢子总蛋白中的NbPTP4、NbPTP5特异地发生免疫反应。间接免疫荧光实验（Indirect immunofluorescence assay,IFA）结果显示两种蛋白的抗体均能与发芽孢子的极管特异结合;免疫电镜（IEM）观察发现anti-NbPTP4的免疫胶体金颗粒能定位于家蚕微粒子虫的极管上。以上结果表明,NbPTP4和NbPTP5为家蚕微粒子虫的极管蛋白。不同于前期研究中NbPTP1、NbPTP2和NbPTP3的定位特征,NbPTP4和NbPTP5定位于极管的前端和锚定盘周围的位置,暗示NbPTP4和NbPTP5可能在极管与宿主细胞互作、极管弹出等方面发挥重要功能。3.NbPTP4细胞结合能力分析及宿主互作靶蛋白筛选与鉴定微孢子虫在未侵染宿主时极管能够稳定、规则地盘绕在孢子内;当外界环境发生改变时,孢子能迅速弹出极管,刺破宿主细胞膜,孢原质能通过中空极管运输到宿主细胞中。极管在微孢子虫侵染宿主过程中与宿主直接接触,它极有可能与宿主之间存在互作关系。细胞结合实验结果显示:NbPTP4重组融合蛋白能与BmE细胞粘附。利用Co-IP方法寻找与NbPTP4互作的宿主靶蛋白,通过对蛋白质谱结果分析,筛选到与NbPTP4互作的宿主靶蛋白可能为家蚕的Tubulin类蛋白、BmHSC70-4等。对Bmtubulinα的定位进行分析,发现Bmtubulinα在未透化处理和透化处理的细胞膜上均有荧光信号,说明Bmtubulinα在宿主细胞内外膜上均有表达。后续利用酵母双杂交、Far-western和Co-IP方法,证实NbPTP4与家蚕Bmtubulinα蛋白存在互作关系。推测家蚕微粒子虫弹出极管后,定位于极管前端NbPTP4可以与宿主细胞表面的Bmtubulinα发生相互作用,在微孢子虫的侵染过程中发挥作用。4.NbPTP4及其宿主互作靶蛋白对家蚕微粒子虫侵染的影响为了进一步研究NbPTP4与Bmtubulinα在微孢子虫侵染宿主过程中的作用,分别利用抗体封闭实验及蛋白竞争实验,证明了当NbPTP4和Bmtubulinα的相互作用受到影响时,家蚕微粒子虫对宿主的侵染率会受到抑制,进一步确认了家蚕微粒子虫NbPTP4与家蚕宿主Bmtubulinα在微孢子虫侵染过程中的重要性。综上所述,本研究对家蚕微粒子虫极管蛋白4（NbPTP4）和极管蛋白5（NbPTP5）进行了鉴定,并对极管蛋白4（NbPTP4）的功能进行了分析,发现了与家蚕微粒子虫侵染相关的宿主互作靶蛋白Bmtubulinα,分析证明了NbPTP4和Bmtubulinα的互作关系,并且证实了这种互作关系在侵染中发挥重要作用。本论文的研究结果为微孢子虫侵染机制的研究提供新的线索和思路。