组织因子(tissue factor,TF)是一种分子量为47kDa的膜性糖蛋白,不仅作为凝血激活因子,在多种生物学过程尤其在肿瘤生长与转移中具有重要意义。TF表达为两种自然发生的蛋白亚型,膜结合的全长TF(flTF)和选择性剪切亚型组织因子(asTF)。实验和临床证据均表明,在肿瘤中有异常的TF表达,并促进肿瘤生长与转移。TF及其剪切亚型(剪切体)的表达和功能的调节受多种因素影响。肿瘤相关刺激信号可调节TF的表达。作为TF转录后调节机制,microRNA直接或间接控制TF的表达和功能。胃癌是最常见的恶性肿瘤之一。目前证实胃癌中有TF表达异常,并且其表达水平与肿瘤的多种生物学行为有关。但asTF在胃癌中的临床意义及调节机制尚不完全明了。本实验通过自行设计asTF的引物和探针应用qRT-PCR方法检测人胃癌组织中flTF、asTF mRNA的表达水平并分析与临床病理的相关性,应用Cox模型探讨其在患者生存时间等预后因素中的价值。体外研究了促炎因子TNF-α刺激胃癌MKN28细胞后flTF、asTF mRNA表达水平的变化。由于长链非编码RNA(lncRNAs)可以作为一种竞争性内源性RNA(ceRNA)与miRNA相互作用,参与靶基因的表达调控,并在肿瘤的发生发展中发挥重要的作用。我们通过构建慢病毒pLVX-H19 lncRNA-shRNA下调载体系统,TF过表达载体,qRT-PCR法检测基因表达水平,WesternBlot检测TF蛋白表达水平,CCK8法测定细胞生长活力,Transwell检测细胞侵袭能力,探讨lncRNA H19与miRNA19a(miR-19a)相互作用通路在胃癌细胞中对flTF、asTF基因表达的调控机制,为TF的转录后调节途径的靶向治疗提供理论依据。本课题结果提示:(1)meta分析结果表明,TF阳性表达与肿瘤区域淋巴结转移之间存在一定的相关性(P=0.001),单变量与多变量相关生存分析TF阳性表达与肿瘤生存、预后之间均存在明显的相关性(P值均<0.0001);我们未发现TF阳性表达与肿瘤瘤体大小、生长之间有相关性;关于asTF在肿瘤中表达及临床意义的研究报道较少,检索到的文献原始数据不足,无法完成meta分析。(2)本研究通过自行设计的检测astf的引物和taqman探针将上游引物设计在第四、第六外显子的连接处,达到了避免同时扩增出fltf基因片段的目的,可高效、准确地检测fltf及astf的基因表达。(3)胃癌组织中fltfmrna相对定量[7.45(0.34~33.68)]显著高于正常胃组织[3.00(1.36~5.02)],胃癌组织中astfmrna相对定量[0.88(0.07~26.00)]显著高于正常胃组织[0.33(0.03~0.97)],差异均有统计学意义(p<0.01)。fltf与astf基因表达水平与性别、年龄、tnm分期、肿瘤大小、组织学分型和化疗敏感性等相关因素的关系差异均无统计学意义(p>0.05)。log-rank生存分析显示fltfmrna低表达组[33.83(25.24~42.43)]比高表达组[18.18(13.32~23.04)]平均术后生存时间显著延长15.66个月(χ2=6.185,p=0.013)。astfmrna低表达组[25.32(21.19~29.45)]比高表达组[20.50(12.51~28.48)]平均术后生存时间显著延长4.82个月(χ2=4.604,p=0.032)。fltfmrna与astfmrna都是低表达组与fltfmrna或astfmrna有一组高表达组比较,平均生存时间(月)及95%ci分别为28.96(24.90~33.00)、23.40(16.27~30.51),患者术后平均生存时间显著延长5.56个月(χ2=4.548,p=0.033)。fltfmrna与astfmrna同时低表达组与fltfmrna与astfmrna同时高表达组比较,平均生存时间(月)及95%ci分别为31.07(23.21~38.92)、11.13(6.90~15.36),患者术后平均生存时间显著延长19.94个月(χ2=13.005,p=0.000)。fltfmrna与astfmrna有一组高表达组较同时高表达组胃癌患者平均生存时间显著延长16.92个月(χ2=6.346,p=0.012)。多因素cox模型分析显示,fltf及astf均是胃癌独立的预后风险因素(hr=6.03,95%ci=1.02~35.71,p<0.05)及(hr=10.74,95%ci=2.32~49.59,p<0.01)。(4)体外实验发现tnf-α刺激下胃癌mkn28细胞的lncrnah19和fltf及astfmrna表达水平增高而mir-19a表达水平降低。mir-19a可与tf3’utr结合抑制其表达,mir-19a可抑制胃癌细胞的tf蛋白水平的表达,fltf/astf可促进胃癌细胞的增殖和侵袭能力,而mir-19a可抑制其促增殖和侵袭作用。下调lncrnah19可促进mir-19a表达水平增高,降低astf/fltf表达水平,抑制胃癌细胞的增殖和侵袭能力。综上所述,我们自行设计的astf引物和taqman探针可较准确地检测astf的基因表达。研究发现astfmrna的表达与fltfmrna一样,在胃癌组织中高表达,且与临床病理无相关性,但与预后密切相关,其表达水平与胃癌患者术后生存时间负相关,联合fltf的基因表达水平预测患者生存时间更有意义。证实tnf-α可体外促进胃癌MKN28细胞TF表达增加,且受lncRNA H19与miR-19a通路的转录后调控,参与促进胃癌的发生与发展。asTF与flTF以及lncRNA H19可作为胃癌预后判断的重要生物学指标。本研究不仅发现了胃癌发生发展过程中TF相关的lncRNA H19与mi R-19a的转录后调节通路,而且为asTF与fl TF以及lncRNA H19在胃癌的靶向免疫治疗提供了实验基础,具有一定的临床应用价值。