椎间盘退变(Intervertebral disc degeneration,IVDD)性疾病可以引发椎间盘突出、退变性腰椎不稳、脊柱退变侧弯,并引发腰背部疼痛等。IVDD是骨科的常见疾病,其主要病理表现为椎间盘组织内蛋白聚糖(Proteoglycans,PGs)与水的含量降低、胶原类型转换、各种基质降解酶活性升高、基质降解酶抑制物活性降低、炎性递质与炎性因子表达增高、细胞凋亡增加等。在导致IVDD的诸多因素中细胞增殖降低、炎性反应及细胞凋亡增加起着非常重要的作用。关于IVDD的明确病因目前仍不十分清楚,但就目前已有的研究结果表明参与IVDD发病的因素包括生物力学、营养代谢、分子生物学、老龄化及遗传等。椎间盘(Intervertebral disc,IVD)由两个独立的解剖区域构成,外层为纤维环(Annulus fibrosus,AF),为一个富含胶原的同心圆层状组织结构；内层为髓核(Nucleus pulposus, NP),为一种富含蛋白聚糖(PGs)和胶原(Collagens)的凝胶状组织结构；髓核的上面和下面分别通过软骨终板(Cartilage end plate,CEP)与椎体相连接。目前研究表明AF使IVD具有抗拉力特性,而NP则使IVD具有抗压缩特性,NP使施加在脊柱上的压力均衡地分散在AF上。虽然IVDD的病理学发病机制尚不十分明确,但很多证据已表明IVDD的进程始于NP,早期的主要病变是髓核细胞(Nucleus pulposus cells,NPCs)数目降低或功能减弱,NPCs是成年NP组织内唯一的结构细胞类型,NPCs的主要作用是合成与分泌正常的细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)成分,而ECM对维持IVD的生理功能发挥重要的作用。NPCs合成代谢降低、基质降解酶活性增强、细胞凋亡及细胞分化增加在NP退变及IVDD发生中起着关键性作用。在IVDD患者的NP组织中,NPCs合成ECM主要成分降低,以Ⅱ型胶原(Collagen type-2)与聚集蛋白聚糖(Aggrecan)为主。另外,各种基质降解酶及降解酶抑制物表达改变也起着重要的作用,其中以基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)活性增高、金属蛋白酶组织抑制物(Tissue inhibitor of metalloproteinases,TIMPs)活性降低、一氧化氮(Nitric oxide, NO)含量增高等为主,另外NPCs凋亡增加在IVDD发生过程中也起着重要的作用。羧甲基壳聚糖(Carboxymethylated chitosan,CMCS)是壳聚糖(Chitosan)的新型衍生物,除具有壳聚糖的一般特性外,还具有良好的水溶性。我们先前的研究已经证实CMCS对骨关节炎的发生及软骨细胞的退变具有一定的保护作用。本研究将CMCS应用于体外培养NPCs,研究CMCS对NPCs增殖、代谢、退变与凋亡的作用并探索其可能的作用机制。第一部分：羧甲基壳聚糖对体外培养大鼠髓核细胞增殖及细胞外基质分泌的影响目的：观察羧甲基壳聚糖对体外培养大鼠椎间盘髓核细胞增殖及分泌Ⅱ型胶原与聚集蛋白聚糖的影响,并探讨其作用机制。方法：取8只三月龄SD (Sprague Dawley)大鼠,引颈处死,取出胸腰段脊柱进行髓核细胞的分离及体外培养,髓核细胞行Ⅱ型胶原及聚集蛋白聚糖免疫组化染色鉴定。将羧甲基壳聚糖加入至传二代髓核细胞中,调整其终浓度分别为10、50、100、200、500、1000μg/mL,作用24小时后通过细胞增殖检测试剂盒(Cell counting kit-8, CCK-8)检测细胞增殖；同样方法培养不同的时间点,分别为6、12、24、48、72小时,检测细胞增殖情况。并通过逆转录-聚合酶链反应(Reverse-transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)和Western blot检测分析羧甲基壳聚糖对髓核细胞内增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuelear antigen, PCNA)在mRNA及蛋白水平表达的影响。通过荧光定量-聚合酶链反应(Real-time PCR)检测羧甲基壳聚糖对髓核细胞内Ⅱ型胶原及聚集蛋白聚糖mRNA表达的影响。结果：髓核细胞经体外培养24小时开始贴壁,培养7天细胞已大片融合。Ⅱ型胶原及聚集蛋白聚糖免疫组化染色表明本研究培养的细胞可分泌Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖。CCK-8检测结果表明羧甲基壳聚糖在50～1000μg/mL浓度范围内对体外培养传二代髓核细胞的增殖具有促进作用(P<0.05),当浓度为200μg/mL时其促增殖效应最明显(P<0.05)。RT-PCR及Western blot检测结果表明不同浓度羧甲基壳聚糖可以增加髓核细胞内PCNA mRNA及蛋白的表达(P<0.05)。另外,通过Real-time PCR检测分析发现不同浓度的羧甲基壳聚糖可以增加髓核细胞内Ⅱ型胶原及聚集蛋白聚糖mRNA的表达,与对照组比较有明显的的差异性(P<0.05),表明羧甲基壳聚糖可以促进髓核细胞合成与分泌细胞外基质。结论：羧甲基壳聚糖对体外培养髓核细胞的增殖具有促进作用,其中PCNA上调在其促髓核细胞增殖中起着重要的作用。羧甲基壳聚糖可以促进体外培养髓核细胞合成分泌细胞外基质。第二部分：羧甲基壳聚糖对体外培养髓核细胞基质降解酶、降解酶抑制物及细胞因子表达的影响目的：观察羧甲基壳聚糖对体外退变髓核细胞内基质金属蛋白酶-3(MMP-3)、金属蛋白酶组织抑制物-1(TIMP-1)、骨形态发生蛋白-2(BMP-2)及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达的影响。方法：取8只三月龄SD大鼠,引颈处死,取出胸腰段脊柱进行髓核细胞的分离与体外培养。通过传代法来构建髓核细胞退变模型,将体外培养髓核细胞传至第五代,通过倒置显微镜观察不同代次细胞形态改变,并通过CCK-8检测不同代次髓核细胞增殖情况。将羧甲基壳聚糖加入至传代退变髓核细胞与原代培养对照组髓核细胞中,调整羧甲基壳聚糖的终浓度为50、100、200μg/mL。通过Real-time PCR法检测髓核细胞内Ⅱ型胶原、MMP-3(Matrix metalloproteinase-3)、TIMP-1(Tissue inhibitor of metalloproteinase-1)、BMP-2(Bone morphogenetic protein-2)及iNOS (Inducible nitric oxide synthase) mRNA的表达情况,分析不同浓度羧甲基壳聚糖对退变髓核细胞上述细胞外基质成分及细胞因子表达的影响。结果：通过倒置显微镜观察不同代次髓核细胞形态学,发现传五代髓核细胞失去了原代细胞的多角形与铺路石样外观,呈现出成纤维细胞样外观。CCK-8检测结果表明传五代髓核细胞其增殖活性明显降低,Real-time PCR检测表明Ⅱ型胶原表达较原代细胞相比明显降低。Real-time PCR检测结果表明传五代髓核细胞内MMP-3与iNOS表达增高,TIMP-1与BMP-2表达降低；50μg/mL～200μg/mL羧甲基壳聚糖对传五代髓核细胞内MMP-3及iNOS mRNA表达增高具有抑制作用,当作用浓度为200μg/mL时作用最明显(P<0.05),50μg/mL～200μg/mL羧甲基壳聚糖对传五代髓核细胞内TIMP-1及BMP-2mRNA表达降低具有促进作用,当作用浓度为200μg/mL时作用最明显(P<0.05)。结论：细胞传代法可以成功诱导体外培养大鼠髓核细胞发生退变,退变髓核细胞其增殖活性与细胞外基质合成与分泌均降低。羧甲基壳聚糖对体外培养退变髓核细胞内MMP-3及iNOS的表达具有抑制作用,对TIMP-1及BMP-2的表达具有促进作用,表明羧甲基壳聚糖对髓核细胞退变具有一定的保护作用,该作用通过促进髓核细胞合成代谢,抑制分解代谢来实现。第三部分：羧甲基壳聚糖对硝普钠诱导体外培养髓核细胞凋亡的保护作用及其机制目的：研究羧甲基壳聚糖对硝普钠诱导体外培养髓核细胞凋亡的保护作用并探讨其可能的作用机制。方法：取8只三月龄SD大鼠,引颈处死,取出胸腰段脊柱进行髓核细胞的分离及体外培养。将不同浓度硝普钠(Sodium nitroprusside, SNP)加入培养的髓核细胞内,使其终浓度分别为1mM、2mM、3mM,通过Annexin-V与PI染色行流式细胞分析(Flow cytometry, FCM)检测硝普钠诱导髓核细胞凋亡的的情况。将羧甲基壳聚糖加入硝普钠诱导髓核细胞与对照组细胞内,调整羧甲基壳聚糖终浓度为50、100、200μg/mL。通过流式细胞检测技术分析不同浓度羧甲基壳聚糖对硝普钠诱导髓核细胞凋亡的影响。通过CCK-8法检测羧甲基壳聚糖对硝普钠诱导髓核细胞增殖的影响。通过Real-time PCR检测羧甲基壳聚糖对硝普钠诱导髓核细胞内Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖、Caspase-3及Bcl-2mRNA表达的影响。通过Western blot法检测羧甲基壳聚糖对硝普钠诱导髓核细胞内Bcl-2蛋白表达的影响。通过Hoechst33342细胞核染色计数荧光显微镜观察分析羧甲基壳聚糖对凋亡髓核细胞核形态改变的影响。通过罗丹明(Rhodamine123, Rho123)染色荧光显微镜观羧甲基壳聚糖对凋亡髓核细胞线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential, MMP)的影响。结果：流式细胞检测结果表明硝普钠在1～3mM浓度范围内可以诱导髓核细胞发生凋亡,呈浓度依赖性。50～200μg/mL羧甲基壳聚糖可降低硝普钠诱导的髓核细胞凋亡。Real-time PCR及Western blot检测结果表明羧甲基壳聚糖可以抑制硝普钠诱导髓核细胞细胞外基质分泌降低,并对硝普钠诱导髓核细胞内Caspase-3mRNA表达增高具有抑制作用,对Bcl-2表达具有促进作用。Hoechst33342检测结果表明羧甲基壳聚糖可降低硝普钠诱导髓核细胞凋亡引起的核改变。罗丹明染色结果表明羧甲基壳聚糖可保护硝普钠诱导髓核细胞线粒体膜电位损害。结论：羧甲基壳聚糖对硝普钠诱导髓核细胞凋亡具有一定的保护作用,其抗凋亡作用是通过改变凋亡激酶Caspase-3及Bcl-2的活性以及改变线粒体膜电位水平实现的。