根际促生细菌(Plant growth promoting rhizobacteria,PGPR)是指生存在根际范围内,对植物生长有促进或对病原菌有拮抗作用的有益细菌的统称。目前已报道的促生机制包括提高氮、磷等营养元素的可利用性,分泌生长素、分裂素、赤霉素等植物激素,产生ACC脱氨酶降低植物体内乙烯含量,产生2,3-丁二醇、3-羟基-2-丁酮等挥发性物质等。芽孢杆菌是一类重要的根际促生细菌,由于其能产生抗逆性强的芽孢、对环境和人畜安全等特性而被广泛地应用于实际生产中。本实验室前期研究发现枯草芽孢杆菌OKB105能够促进烟草和水稻等植物生长、提高烟草对花叶病毒的抗性,还可以用于防治根结线虫病,但是其促生和生防机制尚不完全清楚。本研究通过与水稻互作的枯草芽孢杆菌OKB105表达谱数据分析,结合其突变体文库筛选,确定芽孢杆菌促生相关基因,再对这些基因进行定点突变和功能回复,结合构建突变体、高效液相色谱、Real-time PCR、Elisa等技术确定该促生物质和其促生机理。此外,本研究还评估了芽孢杆菌挥发性物质对水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzoe pv.orzae)的抑菌效果,鉴定出具有抑菌活性的挥发性物质,并研究其抑菌机理。主要研究结果如下:1.枯草芽孢杆菌OKB105能够明显促进水稻株高的生长,促生效果为25.2%。为了揭示其促生机制,我们对与水稻互作2 h的枯草芽孢杆菌OKB105的表达谱进行分析。结果表明,与水稻互作后共有176个基因的表达水平发生差异变化,占枯草芽孢杆菌OKB105转录组的3.8%。针对其功能已知的122个差异表达的基因进行功能分析,主要涉及新陈代谢、转运、运动性、趋化性等方面,其中4组基因受水稻影响最大,分别是:与碳水化合物、氨基酸代谢及转运相关的基因;与转录调控子相关的基因;与产孢、运动性、趋化性相关的基因以及与糖醛酸磷壁酸生物合成相关基因。这些结果表明在芽孢杆菌与植物互作的过程中:(1)芽抱杆菌能够利用植物分泌的物质作为碳源和氮源;(2)芽孢杆菌能够感受周围环境的变化作出反应,提高自身的竞争力;(3)植物能够通过向芽孢杆菌提供能量来间接的影响其产孢及细胞壁成分等。我们通过表达谱芯片技术分析了与水稻互作后的OKB105差异表达基因,为进一步揭示植物与芽孢杆菌的互作机制打下基础。2.我们同时对枯草芽孢杆菌OKB105促生活性物质的基本特性进行研究,发现这种促生物质热稳定,且分子量<3 kDa。随后对构建的OKB105突变体文库中的700个突变体进行筛选,筛选出4个同时对烟草和水稻促生缺陷的突变体。随后通过反向PCR等技术对4个突变体中转座子的插入位点进行鉴定,发现4个被突变基因分别为:yecA基因编码假定的氨基酸/多胺透性酶;yusV基因编码Fe(Ⅲ)-嗜铁素转运蛋白,与Fe(Ⅲ)摄取相关;sigH基因编码RNA聚合酶sigma H因子;comX基因编码信息素前体,与感受态形成相关。结合表达谱数据,我们发现表达谱数据中差异表达的speA基因和本章筛选出的yecA基因都与多胺相关。speA基因编码精氨酸脱羧酶,参与多胺的生物合成,yecA则与多胺转运有关。因此,我们推测枯草芽孢杆菌OKB105对植物的促生活性与多胺有关。3.为了证实这一猜测,我们构建了yecA和speB的定点突变体,编码假定的氨基酸/多胺透性酶的yecA基因和编码胍丁胺酶的speB基因分别参与枯草芽孢杆菌OKB105的多胺分泌和生物合成过程,这两个基因的破坏都会导致OKB105促生能力的缺陷,而speB的功能回复体则会恢复其对植物的促生效果。随后结合衍生及HPLC技术对OKB105及其突变体的发酵上清液进行分析,确定亚精胺是OKB105促进植物生长的关键物质。同时用不同浓度人工合成的亚精胺浸种处理烟草,发现5-100μM的亚精胺确实能够促进烟草根的生长。通过Real-time PCR检测烟草体内促生相关基因的表达水平,发现OKB105、speB功能回复体和5μM亚精胺处理过的烟草的扩张蛋白基因Nt-EKPA1和Nt-EXPA2上调表达,乙烯合成相关基因ACO1下调表达,而ELISA结果同样证明OKB105、speB功能回复体和亚精胺处理能够明显降低烟草叶片的乙烯含量。这些结果表明OKB105分泌的亚精胺在一定程度上通过诱导扩张蛋白相关基因的表达和抑制乙烯的合成来促进植物的生长。我们首次证实了芽孢杆菌通过分泌亚精胺促进植物生长,揭示了芽抱杆菌促生的一种新机制。4.本论文还对芽抱杆菌挥发性物质的抑菌活性进行了评估。首先对50株芽孢杆菌挥发性物质的抑细菌活性进行筛选,发现枯草芽孢杆菌OKB105和蜡样芽孢杆菌D13产生的挥发性物质能够明显抑制水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)的菌落生长和细胞活性。通过扫描电镜和透射电镜技术对Xoo的外部形态和内部结构进行分析,发现对照Xoo细胞壁光滑,细胞呈杆状,而挥发性物质处理后的Xoo细胞壁凹陷,细胞变得畸形、膨胀或是皱缩,不呈杆状,且细胞质浓缩。此外,D13挥发性物质处理能够降低Zoo的致病力和抑制致病相关基因的表达。随后,我们通过气质联用对OKB105和D13产生的挥发性物质进行分析,鉴定出OKB105产生的7个挥发性物质和D13产生的12个挥发性物质。其中,癸醇和3,5,5-三甲基己醇能够抑制Xoo的生长,并且3,5,5-三甲基己醇对水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)、番茄细菌性斑点病菌(Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000)和番茄青枯病菌(Ralstonia solanacearum pv.tomato)也有同样的抑制效果,说明其对病原细菌具有广谱毒性。