[目的]：体外获取骨髓间充质干细胞(Bong mesenchymal stem cells,BMSCs)并培养扩增,在诱导剂的作用下定向分化为不同阶段的胰岛样细胞,然后将各个阶段的细胞移植到兔糖尿病模型中,观察不同阶段细胞归巢情况及对胰岛功能修复能力的差异。[方法]：根据BMSCs密度比较低和容易贴壁生长的特点,采用密度梯度离心和贴壁培养相结合的方法分离兔BMSCs,体外扩增后,用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养扩增,获取稳定生长的骨髓间充质干细胞,并通过形态学特征、表面标记等对骨髓间充质干细胞进行鉴定.实验动物采用3月龄新西兰大白耳兔,体重约2.5kg。随机分为5组,分别为BMSCs移植组5只；细胞诱导7天组10只；细胞诱导14天组10只；细胞诱导21天组10只；模型对照组5只。建立兔糖尿病模型,造模成功后,分别将各个阶段带有GFP标记细胞以3×106cells/kg经耳缘静脉注射移植,观察动物血糖和体重的变化情况。第6w处死动物,制作组织切片,观察不同阶段BMSCs移植对兔胰腺损伤修复的疗效差异。[结果]：①经密度梯度离心获得的MSCs原代细胞,培养4d时即可形成由BMSCs组成的细胞集落；约6-7天时,集落内细胞密集,形态呈短梭形,用0.25%胰蛋白酶消化细胞并用含血清的培养基终止消化进行传代培养,传代后细胞生长较原代快,约5天融合到85%-90%,传至3代时经流式细胞术证实得到较纯BMSCs。通过慢病毒GFP基因转染后不影响细胞正常生长及分化能力,通过流式细胞仪检测细胞表面标记物提示MSC各代均表达CD34, CD45呈阴性,CD73, CD105呈阳性,结果表明我们分离培养得到的BMSCs是具有均—细胞表明特征的细胞群。②在成功分离培养BMSCs的基础了上,我们采用两步法进行了BMSCs体外定向诱导分化为胰岛素分泌细胞：取生长良好的第3代BMSCs,按2×106cells/ml密度接种于6孔板中,每孔加2m1含10-tg/ml碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growthfactor,bFGF)、10μg/ml表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)和2%的B27的L-DMEM培养基：培养6天后,去除旧培养液,用D-Hank’s液冲洗3遍,然后加入含10μm/ml肝细胞生长因子(hepatoeyte growth factor,HGF)、10μg/mlβ细胞调节素(B-cellulin)、10μg/ml活化素A(activinA)、10mmol/L尼克酰胺和2%B27的H-DMEM培养基,继续培养6天。细胞形态略有变化,多呈圆形,少数呈长梭型,开始出现小的细胞簇；约14d多数细胞已聚集成簇,结构上类似胰岛。进一步的Western blot检测和胰岛素免疫组化染色结果表明：诱导的细胞能合成和表达胰岛素,从而为进一步的细胞白体移植提供了细胞来源。③建立稳定的糖尿病动物模型是进行细胞移植的基本条件。我们选用新西兰大耳白兔实验动物,用腹腔注射链脲佐菌素的方法选择性的破坏胰岛B细胞,成功地建立了糖尿病的动物模型。给药后,动物出现明显“三多一少”症状。空腹血糖结果显示,注射后3d内血糖波动较大,3d后血糖逐渐稳定并且明显升高,超过16.7mmol/L,与给药前血糖相比有显著性差异(p<0.01),尿糖始终≥+++,且体重逐渐增加。实验动物没有脱落情况,全部纳入实验。④将各阶段诱导的细胞移植后,6w处死模型兔,取胰腺进行石蜡切片,常规HE染色结果表明：14天组和模型对照组比较有非常显著意义(p<0.01),14天组和BMSCs组、7天组、21天组比较差异有显著意义(p<0.05)。组织形态学显示,细胞归巢及移植存活良好,细胞能够聚集形成细胞簇,免疫组化阳性,血糖值降低。证实移植细胞能够在胰腺内存活,并能分泌胰岛素,受体动物可恢复正常血糖水平。[结论]：本实验成功的获得了BMSCs并进行体外培养和扩增并鉴定了BMSCs,优化了体外诱导分化为胰岛素分泌细胞的条件；成功建立一稳定可重复的糖尿病动物模型；开展了BMSCs向成体细胞不同分化阶段细胞移植治疗胰腺损伤修复的疗效评价和机制的研究,BMSCs移植组、诱导7天组、诱导21天组、移植后血糖水平有所下降,较BMSCs诱导14天组HE染色可见炎细胞浸润,细胞核大深染,内分泌颗粒较少,而BMSCs诱导14天组各项检查指标,West blot检测,微量胰岛素检测提示较其他组有明显优势,结果提示诱导14天组的细胞是比较适合移植的细胞时间和状态。