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造血干细胞是一群具有自我更新能力和血液系统多系分化潜能的细胞。作为造血发育过程中的重要事件,造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)起源一直受到广泛关注。HSC发生具有时间窗短、数量稀少、无特异性表面标志的特点而使得HSC起源研究变得异常困难。我们的工作首先利用多维度实验条件探索将OP9-DL1共孵育后移植实验体系提高至单细胞水平;利用大量分选后系列移植实验(使用超过1200只移植受体)筛选了特异性表面标志组合,和单细胞OP9-DL1共孵育后移植实验,成功对HSC发育早期两类造血干细胞前体(preHSC),即type 1 pre-HSC(T1 pre-HSC)和type 2 pre-HSC(T2 pre-HSC)实现了>30%的高纯度分离,基本过程是:我们通过多种表面标志筛选确定CD201能特异性识别所有功能型T1pre-HSC,为确认加入CD201富集后的群体中所含有的功能型Pre-HSC的频率,我们先后尝试了剂量为3细胞和单个细胞孵育后移植实验,16周后的嵌合情况检测结果分别显示超过80%和30%的受体产生了造血重建,受体的多个造血器官的嵌合情况检测和二次移植证实了这群细胞具有明确的体内各系分化潜能和自我更新潜能。利用3细胞和单细胞移植实验结果,我们通过limited dilution统计学方法计算出现有的T1 pre-HSC表型细胞群体内含有真正功能型的Pre-HSC的频率约为1/2.3;我们利用了单细胞转录组测序挖掘T2 pre-HSC具有富集能力的特异性表面标志:主成分分析和未经高纯度富集的T2 pre-HSC群体中内皮和造血相关基因表达情况分析显示,此前被用于高纯度富集T1 pre-HSC的表面标志CD201可能同样能够被用来富集T2 pre-HSC,随后对含T2 pre-HSC的新群体进行了3-细胞和单细胞的孵育后移植实验,结果显示超过80%和30%的受体获得了长期多系造血重建;二次移植结果体现他们体内自我更新能力完善。通过limited dilution分析可得出这群T2 pre-HSC群体内的功能型的Pre-HSC的纯度大约是1/2.1。至此,T2 pre-HSC也首次成功的被高纯度分离。随后,我们对T1 pre-HSC和T2 pre-HSC群体、内皮细胞(endothelial cell,EC)、E12/14胎肝(fetal liver,FL)中的成熟型HSC(即E12 HSC和E14 HSC)共5群HSC发育过程中的代表性阶段的细胞进行单细胞转录组测序;通过对高!通量测序数据的挖掘,我们发现,在5个群体连续发育的过程中,他们在转录活性、阶段特异性表达基因、转录因子、表面标志、信号通路和细胞周期等方面呈现多样性和阶段性的分子表达特征。非监督系统性聚类分析(unsupervisedhierarchicalclusteringanalysis)和主成分分析(principalcomponentanalysis,pca)结果呈现了较为明显的发育上ec-t1pre-hsc-t2pre-hsc-e12/14hsc的连续性。monocle分析结果也显示了hsc的基本发育过程。我们根据各组细胞的转录组分子表达水平进行了阶段差异性基因分析,结果显示在ec-t1pre-hsc转变过程基因的上调或者下调现象最为活跃,暗示着内皮向造血转化过程中进行大量的转录活动;而e12hsc-e14hsc阶段上下调变化的基因最少,提示两类细胞在发育上的相似性。goterm分析和聚类分析显示部分血管生成相关基因存在明显的阶段特异性表达,这些基因在hsc发育的5个阶段中的基因数目和单细胞中基因的表达水平均呈现出ec-t1pre-hsc过程中上升,随后逐渐下降的整体趋势。5类细胞动静脉相关基因的表达谱分析显示pre-hsc保留了部分动脉基因的表达,但几乎不表达静脉基因,暗示pre-hsc可能来源于动脉内皮,支持hsc动脉起源理论。随后,我们根据基因在不同阶段的表达趋势的变化特征和pca分析结果挖掘了一类具有相似表达变化趋势的基因(被命名为模式基因,patterngene)。若干hsc相关转录因子均被发现表达于所有的t1pre-hsc;此外,t1pre-hsc还表达若干红系特异性转录调控分子。pre-hsc和hsc群体还不同程度的表达曾被报道与造血祖细胞系相关的多个关键转录因子和重编程相关转录因子。我们通过对测序数据的挖掘确定了表面分子cd47可能对hsc多个发育阶段具有持续识别作用,继而利用系列移植/孵育后移植实验发现几乎所有胚胎期agm区内hsc相关群体(e10.5pre-hsc和e11.5hsc)和具有产生hsc潜能的内皮细胞均表达cd47。通过对比pre-hsc、pre-hsc相近群体(不具备pre-hsc潜能)和成体骨髓中hsc的基因表达特征,我们挖掘到了pre-hsc的98个标志基因。其中包含了曾被报道通过结合受体tie2发挥调控骨髓hsc微环境(hscniche)静息状态的分泌性细胞因子angiopoietin1(angpt1)、gprotein偶联受体的膜蛋白分子(gpr56,vipr1和vipr2)与细胞增殖与造血迁移有关的调控因子fgfr3。此外,对细胞周期相关基因在pre-hsc群体内的表达谱分析显示,pre-hsc呈现明显的相对静息和增殖活跃特征,功能实验证实pre-hsc部分处于g0期,另一部分处于sg2m期,提示部分pre-hsc具有增殖活跃的内在特征,与后续的造血干细胞数量急剧增加密切相关。通过gsea(genesetenrichmentanalysis)方法比对kegg(kyotoencyclopediaofgenesandgenomes)数据库进行信号通路方面的分析,结果显示多个信号通路在hsc发生过程中呈现活跃的变化。t1pre-hsc(相比ec群体)!显著富集Fc gamma R和Fc epsilon RI介导的细胞吞噬等细胞膜-骨架协作关联调控(membrane-cytoskeleton-coupled processes),与此前报道对含有HSC的AGM区细胞进行芯片分析的结果类似。本研究中的5类群体中,对比EC与后续4类HSC相关群体可以明确富集糖酵解过程(glycolysis),这与曾被报道成年骨髓腔内静息状态下的HSC大部分处于低氧环境中(hypoxic niches)的结论一致。此外,氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)过程中的NADH脱氢酶和三磷酸酶(ATPases)也被显著富集在T1 pre-HSC中,暗示线粒体有氧呼吸(mitochondrial aerobic respiration)在T1 pre-HSC阶段处于高度活化状态。该过程不仅能高效产能,还利于氨基酸和脂肪代谢(facilitate amino acid and fatty acid metabolism)。我们还发现mTOR信号通路(mammalian target of rapamycin)被高度富集在T1 pre-HSC群体中(相比EC)。上述多个角度的功能学验证证实单细胞转录组测序数据的可靠性与潜在价值。总之,在造血发育过程中,我们的研究为清晰了解造血干细胞起源,以至于整个造血发育规律、iPSCs、重编程等领域提供了重要的数据基础和理论依据。