红稗花青素提纯、鉴别及生物活性研究

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本论文以红稗为原料,使用超声波辅助技术提取花青素,在单因素试验的基础上,进行响应面试验,优化红稗花青素提取工艺。选用大孔吸附树脂对红稗花青素进行纯化,以六种植物中常见花青素为对照,使用高效液相色谱法测定红稗花青素的种类和含量,研究了高效液相色谱法测定红稗花青素的的线性关系、精密度及加标回收率。使用微弱发光仪测定红稗花青素提取物的超氧阴离子、过氧化氢、羟自由基清除率以及DNA损伤保护活性,并进行了DPPH的清除作用和抑菌活性试验。主要研究结果如下:(1)单因素试验表明,料液比为1:30 g/m L,盐酸浓度为3 mol/L,乙醇体积比为3:1,提取时间为15 min,提取功率为200 W时,红稗花青素提取效果最好。在单因素试验基础上,响应面试验表明,红稗花青素最佳提取条件:料液比为1:32 g/m L,盐酸浓度为2.6 mol/L,乙醇体积比为4.6:1,提取时间为16 min。在此条件下进行3次验证性试验,红稗花青素提取率为7.18%,与理论预测值(7.26%)较为接近,说明模型的拟合程度较好,所拟合的回归方程对红稗花青素提取工艺进行分析和预测是可靠的。(2)通过静态吸附和解吸研究,得出S-8型大孔树脂吸附时间为0.5 h1.0 h,解吸时间以3.0 h4.0 h为宜。当吸附和解吸基本达到平衡时,吸附率为92.17%,解吸率为87.23%。与其它6种大孔树脂对比,其吸附率大,解吸率高,吸附和解吸时间均较短,适合纯化红稗花青素。大孔树脂静态解吸试验表明,pH为1.0,乙醇浓度为70%时,静态解吸效果最好。动态试验表明,进样速率为1.0 m L/min,进样浓度为2.00 mg/mL时,动态吸附效果最好,洗脱流速为1.0 mL/min时,动态解吸效果最好。(3)使用高效液相色谱法测定红稗花青素种类和含量,6种花青素标准品飞燕草色素、矢车菊色素、矮牵牛色素、天竺葵色素、芍药色素、锦葵色素出峰时间依次为8.585、9.986、10.252、11.832、12.464和12.697 min。出峰时间均在720 min以内,基线基本分离。红稗花青素主要为矢车菊色素和天竺葵色素,含量分别为689 mg/kg和80 mg/kg。高效液相色谱法测定花青素,线性关系良好,具有较高的精密度和加标回收率,说明其是一种有效的定量分析方法。(4)抗氧化和DNA损伤保护活性试验表明,随着样品浓度的升高,清除率上升,呈剂量-效应关系。在邻苯三酚-鲁米诺化学发光体系中,当质量浓度为12.5 mg/m L时,对超氧阴离子自由基的清除率为46.45%,其IC50值为15.37mg/m L;在鲁米诺-过氧化氢化学发光体系中,质量浓度为10μg/mL时,对过氧化氢的清除率为50.05%,IC50为8.14μg/m L;在硫酸亚铁-鲁米诺-过氧化氢化学发光体系中,当浓度为1000μg/m L时,对羟基自由基的清除率达到96.78%,IC50为88.89μg/mL。在CuSO4-Phen-VC-H2O2-DNA化学发光体系中,对DNA损伤的半抑制浓度IC50值为0.85 mg/m L。对DPPH的清除作用试验表明,当红稗花青素的浓度为106.67μg/mL时,其清除率达到最大值62.81%。抑菌实验结果表明,红稗花青素提取物对金黄色葡萄球菌、阪崎肠杆菌、沙门氏菌均有抑菌作用,并且随着浓度的增大其抑菌作用增强。对沙门氏菌的抑制作用优于金黄色葡萄球菌、阪崎肠杆菌。
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