DNA纳米生物界面(DNAnano-biointerfaces),有时也被称为智能纳米生物界面(smartnano-biointerfaces),是生物医学研究中一个细分的、且具有自己独特定义的研究领域,一般是由具有特殊功能的DNA分子与各种各样的纳米材料通过物理、化学等方式连接而成。这类纳米生物界面可以响应外部刺激(如生物识别事件、pH、温度),并产生累积的微观界面变化,从而改变其宏观属性。由于可以充分融合DNA精确可控的组装能力和独特的生物活性以及纳米材料丰富的生物、物理、化学性质,DNA纳米生物界面因此拥有了丰富的多样性、功能性和高度的均一性、可重现性。近十年来,DNA纳米生物界面作为传感模块,也被广泛应用于生物传感器的研发,并产生了一系列新的关于分析工具和示踪探针的设计方法和理念,促进了对生物活性物质特异、灵敏、快速、低成本、原位的分析。不仅有助于进一步阐明生命的分子机制,而且推进了疾病的预警与早期治疗。随着生物学、医学及其交叉学科在广度和领域深度上不断取得进展,复杂的生物系统和生物过程提示我们,存在于其中的功能多样性远远超过目前基于纳米材料科学所获得的研究成果。同时,受知识体系和技术的局限,学术界对于纳米生物界面仍缺乏全面的认识。因此,在可预见的未来,针对DNA纳米生物界面的研究依然是包括生化分析在内的诸多领域研究的热点和重要方向。DNA纳米生物界面的研究内容十分丰富,本论文工作主要包括新型DNA纳米生物界面的构建、DNA在纳米材料上的界面行为,在此基础上利用DNA纳米生物界面研制生物传感系统,促进其在分子识别以及信号传导、转换和放大等方面的应用,以提高DNA纳米生物界面在复杂样品如血液和活细胞中的传感性能,从而发展新的生化分析方法,推进纳米生物传感技术在生物医学研究及临床诊断与疾病监测中的应用。蛋白质是生命体生存的物质基础之一,参与了生命体的各项活动,如遗传、发育、新陈代谢等生命基本过程。同时,蛋白质在生物体内的浓度变化蕴含着丰富的与疾病相关的信息,是最主要的疾病诊断生物标志物之一。有鉴于此,在本论文工作中,我们以蛋白质疾病标志物在胞内、外的分析为目标,以蛋白质响应的DNA纳米生物界面为传感模块,构建了可对蛋白质原位分析或体外检测的生物传感系统,并且充分利用蛋白质特异的识别特性,通过优化实验操作流程,分别构建了单刺激、双刺激和通用蛋白质响应型DNA纳米生物界面,并且发展了相关的生化分析应用研究。具体工作如下:1、单刺激响应型DNA纳米生物界面用于肿瘤细胞端粒酶定量检测及胞内原位成像端粒酶通过在染色体末端添加重复DNA序列(5′-TTAGGG-3′)来维持基因组的完整性,其在体内的表达受到严格调控,因此在大部分体细胞中检测不到端粒酶的活性。然而,在85-90%的原发性肿瘤中,端粒酶的表达显著性上调。基于这个明显的差异,端粒酶被视作一个普遍的恶性肿瘤标志物,能够很好地反应肿瘤发生及发展的情况。为此,基于端粒酶独特的DNA序列延伸方式,我们构建了一种DNA构象可转换的智能纳米生物界面,用于肿瘤细胞端粒酶的定量检测及胞内原位成像。该纳米生物界面的构建是通过在金纳米颗粒(goldnanoparticles,AuNPs)表面修饰一层荧光基团(FAM)连接的发夹DNA分子探针(molecularprobes),简称AuNP-MPs。当AuNP-MPs与端粒酶相互作用时,由于端粒酶特殊的扩增能力,发夹DNA的3′-端序列将作为引物以DNA序列(TTAGGG)为单元被持续延伸,从而引发发夹DNA的构象发生改变,导致原本被猝灭的荧光基团因远离了AuNPs表面而得以恢复,荧光恢复的强度与端粒酶的活力呈现正相关关系,因此能快速地反映肿瘤细胞内端粒酶的表达情况,而且能够对肿瘤细胞和正常细胞进行特异性的鉴别。AuNP-MPs的构建方式和组成成分都非常简单,因此对于监测癌症进展、评估癌症治疗效果具有较大的应用潜力。2、双刺激响应型DNA纳米生物界面用于线粒体释放细胞色素c的原位分析细胞色素c(cytochromec,Cytc)在细胞凋亡过程中起着至关重要的作用。在线粒体凋亡通路的信号传导中,Cytc从线粒体释放到细胞质是一个高度特异性的事件。在凋亡的细胞中,对Cytc的释放进行原位和实时监测不仅有益于监测细胞凋亡进展,而且有助于对细胞凋亡分子机制的研究。因此,我们使用核酸适配体构建了一个锰超氧化物歧化酶(manganesesuperoxidedismutase,MnSOD)mRNA和Cytc双刺激的DNA纳米生物界面,用于凋亡细胞中Cytc释放的原位成像和动态监测。该DNA纳米生物界面是通过在AuNPs表面组装了一层精心设计的Y型(Y-shaped)DNA构建而成,完整的组装体作为一个DNA纳米器件通过叶酸-叶酸受体介导的途径进入细胞质,只有当MnSODmRNA和Cytc同时存在于细胞质中,DNA纳米器件才能被激活并产生荧光,实现Cytc释放的实时监测。在此基础上,我们通过对该DNA纳米器件执行“与”逻辑门操作,可以实现细胞凋亡通路的原位分析。在这部分研究工作中,我们对细胞凋亡研究提出了一个新的研究策略:从对信号网络中单个信号分子的独立研究转为上下游信号分子的捆绑式研究,即由单个独立的“点”转为直接分析由“点”组成的“线”。因为细胞凋亡信号网络实际上是由类似于“线”的凋亡信号通路所构成,因此我们的研究工作将有助于对信号通路的系统性研究。3、通用型DNA纳米生物界面用于建立基于血糖仪的多种蛋白质分析方法个人血糖仪(personalglucosemeter,PGM)在非葡萄糖类生物标志物分析检测中的应用已经极大地促进了疾病标志物即时检测(point-of-caretesting,POCT)的发展,然而,以往的研究大多针对核酸标志物的分析。考虑到许多临床生物标志物和治疗靶点都是蛋白质,因此发展基于PGM的蛋白质即时检测,不仅对病人的诊疗具有较大的帮助,而且有助于医疗器件的发展。但是,建立一个有效的与PGM相匹配的生物传感系统用于将蛋白质靶标转化为对葡萄糖的测量一直面临着很大的挑战。因此,我们进一步探索了DNA纳米生物界面与核酸信号放大技术的结合,并且在构建的DNA-Au-Fe_3O_4纳米生物界面基础上设计了一个信号转换和放大系统,在与PGM整合后研制了一个可以与PGM相匹配的通用系统用于蛋白质疾病标志物的即时分析。同时,为了在PGM信号和蛋白质靶标之间建立更加有效的关联,该系统的设计基于上游蛋白质靶标响应的催化发夹组装(catalytichairpinassembly,CHA)反应和下游用于指导蔗糖转化酶聚合作用的杂交链式反应(hybridizationchainreaction,HCR)的整合,简称为CHA-HCR系统。作为一个“即插即用”的信号转换器和放大器,CHA-HCR系统能在蛋白质靶标存在时立即启动,指导蔗糖转化酶组装到共聚的双链DNA上,形成可级联生产葡萄糖的DNA-转化酶纳米复合物。使用该系统并且与PGM结合,我们成功实现了血清中多种蛋白质疾病标志物的定量分析。由于CHA-HCR系统具有较大的灵活性和可编程性,所以我们研制的生物传感器可以很容易地扩展用于其他非葡萄糖靶标的定量分析,对于疾病诊断和预防具有广泛的应用潜力。