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目的:
Orexins(胖素,Orexin-A和Orexin-B)是下丘脑分泌的神经肽,主要参与摄食和奖赏调控,尤其是Orexin-A在该调控过程中扮演重要角色.在下丘脑,表达Orexin的神经元主要分布于外侧区(Lateral Hypothalamus,LHA)和穹隆周区(Perifornical Area,PFA).研究发现,啮齿类动物侧脑室、下丘脑室旁核(Paraventricular Nucleus, PVN)、LHA或PFA微量注射Orexin-A,均可促进大鼠摄食.虽然侧脑室注射Orexin-B也能产生与Orexin-A类似的促摄食效应,但核团内注射Orexin-B无促食效应.另有研究发现,Orexin-A或Orexin-B的促食效应依赖于Orexin-1受体(OX-1R).但Orexins对肥胖或肥胖抵抗大鼠葡萄糖敏感(GS)神经元兴奋性、以及摄食和胃功能等调控研究较少.因此,本研究拟采用荧光免疫组化、分子生物学、电生理学等方法,观察和比较下丘脑LHAOrexin-A和OX-1R免疫阳性细胞及其mRNA在正常、肥胖及肥胖抵抗大鼠表达的异同,以及LHAOrexin-A对GS神经元兴奋性、摄食和胃功能的影响及潜在机制,并比较和分析Orexin-A在这三组大鼠中调控效应差异,目的是补充和完善Orexin-A对能量平衡调控理论,为临床肥胖治疗提供新的研究思路.
方法:
建立肥胖和肥胖抵抗大鼠模型:选取雄性健康SD大鼠(180-200g),高脂饲料(每100g含基础饲料80g,蛋黄粉10g,猪油10g)饲喂2周,随之根据大鼠体质增量对大鼠进行排序,体质增量排序位于中间1/3的大鼠转喂基础饲料,其作为正常大鼠进行后续研究;体质增量排序位于上1/3(体质增量多)或下1/3(体质增量少)的大鼠继续以高脂饲料喂养6周,再次排序,体质增量位于上1/3为肥胖大鼠,体质增量位于下1/3为肥胖抵抗大鼠,弃去体质增量排序位于中间1/3的大鼠.
采用荧光免疫组织化学染色和Realtime-PCR方法,比较和分析正常、肥胖和肥胖抵抗大鼠LHA内Orexin-A和OX-1R免疫阳性细胞及其mRNA表达的异同.采用单细胞外放电记录,观察Orexin-A对正常、肥胖和肥胖抵抗大鼠GS神经元放电活动的影响,以及黑皮质素3和4受体(Melanocortin 3/4 Receptors,MC3/4R)信号通路的调控.
采用LHA核团置管术和核团微量注射药物,观察Orexin-A对正常、肥胖和肥胖抵抗大鼠摄食、胃运动及胃排空的影响,以及OX-1R和MC3/4R信号通路的调控.
将正常、肥胖以及肥胖抵抗大鼠均随机分为6组:(1)生理盐水(NS)组:LHA注射NS;(2)Orexin-A组:LHA内微量注射100pmolOrexin-A;(3)SB-334837组:LHA微量注射1nmolOrexin-1受体拮抗剂SB-334837;(4)SHU9119组:LHA微量注射0.1μgMC3/4R受体拮抗剂SHU9119;(5)Orexin-A+SB-334837组:LHA微量注射1nmolSB-334837+100pmolOrexin-A混合液;(6)Orexin-A+SHU9119组:LHA微量注射0.1μgSHU9119+100pmolOrexin-A混合液.每组给药总体积为0.5μL,
结果:
荧光免疫组化结果显示,正常、肥胖及肥胖抵抗大鼠下丘脑LHA内Orexin-A免疫阳性细胞表达无显著差异(P>0.05).但与正常大鼠相比,肥胖大鼠或肥胖抵抗大鼠LHA内OX-1R免疫阳性细胞表达显著增多(P<0.05-0.01),且肥胖抵抗大鼠增加的更为显著(P<0.05).
PCR结果进一步证实,在正常、肥胖及肥胖抵抗大鼠,LHA内Orexin-AmRNA表达无显著改变(P>0.05),但与正常大鼠相比,肥胖和肥胖抵抗大鼠LHA内OX-1RmRNA表达显著增加(P<0.05-0.01),尤其是肥胖抵抗大鼠的增加最为显著(P<0.05).
电生理研究显示,在正常大鼠LHA微量注射Orexin-A,葡萄糖兴奋性(GS-EXC)神经元放电频率显著降低(由5.93±1.84Hz降低至3.78±0.73Hz;P<0.05);而葡萄糖抑制性(GS-INH)神经元放电频率则显著升高(由5.47±1.64Hz升高至7.62±1.84Hz;P<0.05);若预先LHA微量注射SB-334867再给予Orexin-A,Orexin-A对GS神经元的兴奋或抑制效应可被完全阻断;若预先LHA微量注射SHU9119再给予Orexin-A,可使Orexin-A对GS神经元的兴奋或抑制效应进一步增强(P<0.05).
在肥胖大鼠,LHA微量注射Orexin-A,GS-EXC神经元的放电频率由6.12±1.68Hz降低至3.24±0.97Hz(P<0.05);而GS-INH神经元放电频率由5.26±1.82Hz升高至8.19±2.37Hz(P<0.05);若预先LHA注射SB-334867再给予Orexin-A,Orexin-A对GS神经元的兴奋或抑制效应可被完全阻断,但若预先LHA注射SHU9119再给予Orexin-A,Orexin-A对GS神经元的兴奋或抑制效应进一步增强(P<0.05).
在肥胖抵抗大鼠,LHA微量注射Orexin-A,GS-EXC神经元放电频率显著降低(由5.86±1.94Hz降低至3.07±0.84Hz;P<0.05),而GS-INH神经元放电频率显著增加(由5.39±1.48Hz升高至8.19±2.42Hz;P<0.05);若预先LHA注射SB-334867再给予Orexin-A,Orexin-A对GS神经元的兴奋或抑制效应同样可被完全阻断;而LHA预先注射SHU9119再给予Orexin-A,同样,Orexin-A对GS神经元的兴奋或抑制效应进一步增强(P<0.05).
与正常大鼠相比,Orexin-A对肥胖或肥胖抵抗大鼠GS神经元的兴奋或抑制效应显著增强(P<0.05),SHU9119对Orexin-A诱导的GS神经元兴奋性改变更为显著(P<0.05),即黑皮质素3/4受体信号通路对Orexin-A该效应的调控更为敏感.但这些调控效应在肥胖大鼠和肥胖抵抗大鼠之间无明显差异(P>0.05).
摄食量研究结果显示,LHA微量注射Orexin-A,正常、肥胖和肥胖抵抗大鼠0-2h摄食量均显著增加(P<0.05),且肥胖和肥胖抵抗大鼠摄食量增加的幅度显著高于正常大鼠(P<0.05),尤以肥胖抵抗大鼠摄食量增加最为显著(P<0.05).预先LHA注射SB-334867,可完全阻断Orexin-A促大鼠摄食效应(P>0.05);若LHA注射SHU9119+Orexin-A混合液,可显著增强Orexin-A促摄食效应(P<0.05).
在体胃运动研究结果显示,大鼠下丘脑LHA微量注射Orexin-A,5min后胃收缩频率及幅度显著增加(P<0.05),且该效应可被LHA注射SB-334867完全阻断;与Orexin-A组相比,LHA微量注射Orexin-A+SHU9119混合液,大鼠胃收缩频率及幅度显著升高(P<0.05).提示,黑皮质素3/4受体信号通路参与Orexin-A促大鼠胃收缩频率及幅度的调控(P<0.05).胃运动指数(MI)分析结果显示,在正常、肥胖及肥胖抵抗大鼠之间MI无明显差异(P>0.05);但LHA微量注射Orexin-A,三组大鼠MI均显著升高(P<0.05),其中肥胖及肥胖抵抗大鼠升高幅度显著高于正常大鼠(P<0.05),且肥胖抵抗大鼠升高幅度高于肥胖大鼠(P<0.05).Orexin-A对大鼠MI的促进作用可被LHA注射SB-334867完全阻断(P<0.05),而LHA注射SHU9119能增强Orexin-A对大鼠MI的促进作用(P<0.05).
胃排空研究结果显示,下丘脑LHA微量注射Orexin-A,三组大鼠胃排空显著增加(P<0.05),Orexin-A对胃排空的促进作用强弱依次为肥胖抵抗大鼠>肥胖大鼠>正常大鼠(P<0.05).LHA注射SB-334867,可完全阻断Orexin-A对胃排空的促进作用;若LHA注射SHU9119,可增强Orexin-A促大鼠胃排空效应(P<0.05).
结论:
Orexin-A在下丘脑LHA参与正常、肥胖和肥胖抵抗大鼠GS神经元兴奋性、胃动力、胃排空以及摄食活动调控,该效应可能是通过OX-1R信号通路而实现的;MC3/4R受体信号通路可能也参与了该过程的调控;Orexin-A上述调控效应在肥胖和肥胖抵抗大鼠更为显著,其可能与肥胖和肥胖抵抗大鼠LHA中OX-1R表达增加有关.
Orexins(胖素,Orexin-A和Orexin-B)是下丘脑分泌的神经肽,主要参与摄食和奖赏调控,尤其是Orexin-A在该调控过程中扮演重要角色.在下丘脑,表达Orexin的神经元主要分布于外侧区(Lateral Hypothalamus,LHA)和穹隆周区(Perifornical Area,PFA).研究发现,啮齿类动物侧脑室、下丘脑室旁核(Paraventricular Nucleus, PVN)、LHA或PFA微量注射Orexin-A,均可促进大鼠摄食.虽然侧脑室注射Orexin-B也能产生与Orexin-A类似的促摄食效应,但核团内注射Orexin-B无促食效应.另有研究发现,Orexin-A或Orexin-B的促食效应依赖于Orexin-1受体(OX-1R).但Orexins对肥胖或肥胖抵抗大鼠葡萄糖敏感(GS)神经元兴奋性、以及摄食和胃功能等调控研究较少.因此,本研究拟采用荧光免疫组化、分子生物学、电生理学等方法,观察和比较下丘脑LHAOrexin-A和OX-1R免疫阳性细胞及其mRNA在正常、肥胖及肥胖抵抗大鼠表达的异同,以及LHAOrexin-A对GS神经元兴奋性、摄食和胃功能的影响及潜在机制,并比较和分析Orexin-A在这三组大鼠中调控效应差异,目的是补充和完善Orexin-A对能量平衡调控理论,为临床肥胖治疗提供新的研究思路.
方法:
建立肥胖和肥胖抵抗大鼠模型:选取雄性健康SD大鼠(180-200g),高脂饲料(每100g含基础饲料80g,蛋黄粉10g,猪油10g)饲喂2周,随之根据大鼠体质增量对大鼠进行排序,体质增量排序位于中间1/3的大鼠转喂基础饲料,其作为正常大鼠进行后续研究;体质增量排序位于上1/3(体质增量多)或下1/3(体质增量少)的大鼠继续以高脂饲料喂养6周,再次排序,体质增量位于上1/3为肥胖大鼠,体质增量位于下1/3为肥胖抵抗大鼠,弃去体质增量排序位于中间1/3的大鼠.
采用荧光免疫组织化学染色和Realtime-PCR方法,比较和分析正常、肥胖和肥胖抵抗大鼠LHA内Orexin-A和OX-1R免疫阳性细胞及其mRNA表达的异同.采用单细胞外放电记录,观察Orexin-A对正常、肥胖和肥胖抵抗大鼠GS神经元放电活动的影响,以及黑皮质素3和4受体(Melanocortin 3/4 Receptors,MC3/4R)信号通路的调控.
采用LHA核团置管术和核团微量注射药物,观察Orexin-A对正常、肥胖和肥胖抵抗大鼠摄食、胃运动及胃排空的影响,以及OX-1R和MC3/4R信号通路的调控.
将正常、肥胖以及肥胖抵抗大鼠均随机分为6组:(1)生理盐水(NS)组:LHA注射NS;(2)Orexin-A组:LHA内微量注射100pmolOrexin-A;(3)SB-334837组:LHA微量注射1nmolOrexin-1受体拮抗剂SB-334837;(4)SHU9119组:LHA微量注射0.1μgMC3/4R受体拮抗剂SHU9119;(5)Orexin-A+SB-334837组:LHA微量注射1nmolSB-334837+100pmolOrexin-A混合液;(6)Orexin-A+SHU9119组:LHA微量注射0.1μgSHU9119+100pmolOrexin-A混合液.每组给药总体积为0.5μL,
结果:
荧光免疫组化结果显示,正常、肥胖及肥胖抵抗大鼠下丘脑LHA内Orexin-A免疫阳性细胞表达无显著差异(P>0.05).但与正常大鼠相比,肥胖大鼠或肥胖抵抗大鼠LHA内OX-1R免疫阳性细胞表达显著增多(P<0.05-0.01),且肥胖抵抗大鼠增加的更为显著(P<0.05).
PCR结果进一步证实,在正常、肥胖及肥胖抵抗大鼠,LHA内Orexin-AmRNA表达无显著改变(P>0.05),但与正常大鼠相比,肥胖和肥胖抵抗大鼠LHA内OX-1RmRNA表达显著增加(P<0.05-0.01),尤其是肥胖抵抗大鼠的增加最为显著(P<0.05).
电生理研究显示,在正常大鼠LHA微量注射Orexin-A,葡萄糖兴奋性(GS-EXC)神经元放电频率显著降低(由5.93±1.84Hz降低至3.78±0.73Hz;P<0.05);而葡萄糖抑制性(GS-INH)神经元放电频率则显著升高(由5.47±1.64Hz升高至7.62±1.84Hz;P<0.05);若预先LHA微量注射SB-334867再给予Orexin-A,Orexin-A对GS神经元的兴奋或抑制效应可被完全阻断;若预先LHA微量注射SHU9119再给予Orexin-A,可使Orexin-A对GS神经元的兴奋或抑制效应进一步增强(P<0.05).
在肥胖大鼠,LHA微量注射Orexin-A,GS-EXC神经元的放电频率由6.12±1.68Hz降低至3.24±0.97Hz(P<0.05);而GS-INH神经元放电频率由5.26±1.82Hz升高至8.19±2.37Hz(P<0.05);若预先LHA注射SB-334867再给予Orexin-A,Orexin-A对GS神经元的兴奋或抑制效应可被完全阻断,但若预先LHA注射SHU9119再给予Orexin-A,Orexin-A对GS神经元的兴奋或抑制效应进一步增强(P<0.05).
在肥胖抵抗大鼠,LHA微量注射Orexin-A,GS-EXC神经元放电频率显著降低(由5.86±1.94Hz降低至3.07±0.84Hz;P<0.05),而GS-INH神经元放电频率显著增加(由5.39±1.48Hz升高至8.19±2.42Hz;P<0.05);若预先LHA注射SB-334867再给予Orexin-A,Orexin-A对GS神经元的兴奋或抑制效应同样可被完全阻断;而LHA预先注射SHU9119再给予Orexin-A,同样,Orexin-A对GS神经元的兴奋或抑制效应进一步增强(P<0.05).
与正常大鼠相比,Orexin-A对肥胖或肥胖抵抗大鼠GS神经元的兴奋或抑制效应显著增强(P<0.05),SHU9119对Orexin-A诱导的GS神经元兴奋性改变更为显著(P<0.05),即黑皮质素3/4受体信号通路对Orexin-A该效应的调控更为敏感.但这些调控效应在肥胖大鼠和肥胖抵抗大鼠之间无明显差异(P>0.05).
摄食量研究结果显示,LHA微量注射Orexin-A,正常、肥胖和肥胖抵抗大鼠0-2h摄食量均显著增加(P<0.05),且肥胖和肥胖抵抗大鼠摄食量增加的幅度显著高于正常大鼠(P<0.05),尤以肥胖抵抗大鼠摄食量增加最为显著(P<0.05).预先LHA注射SB-334867,可完全阻断Orexin-A促大鼠摄食效应(P>0.05);若LHA注射SHU9119+Orexin-A混合液,可显著增强Orexin-A促摄食效应(P<0.05).
在体胃运动研究结果显示,大鼠下丘脑LHA微量注射Orexin-A,5min后胃收缩频率及幅度显著增加(P<0.05),且该效应可被LHA注射SB-334867完全阻断;与Orexin-A组相比,LHA微量注射Orexin-A+SHU9119混合液,大鼠胃收缩频率及幅度显著升高(P<0.05).提示,黑皮质素3/4受体信号通路参与Orexin-A促大鼠胃收缩频率及幅度的调控(P<0.05).胃运动指数(MI)分析结果显示,在正常、肥胖及肥胖抵抗大鼠之间MI无明显差异(P>0.05);但LHA微量注射Orexin-A,三组大鼠MI均显著升高(P<0.05),其中肥胖及肥胖抵抗大鼠升高幅度显著高于正常大鼠(P<0.05),且肥胖抵抗大鼠升高幅度高于肥胖大鼠(P<0.05).Orexin-A对大鼠MI的促进作用可被LHA注射SB-334867完全阻断(P<0.05),而LHA注射SHU9119能增强Orexin-A对大鼠MI的促进作用(P<0.05).
胃排空研究结果显示,下丘脑LHA微量注射Orexin-A,三组大鼠胃排空显著增加(P<0.05),Orexin-A对胃排空的促进作用强弱依次为肥胖抵抗大鼠>肥胖大鼠>正常大鼠(P<0.05).LHA注射SB-334867,可完全阻断Orexin-A对胃排空的促进作用;若LHA注射SHU9119,可增强Orexin-A促大鼠胃排空效应(P<0.05).
结论:
Orexin-A在下丘脑LHA参与正常、肥胖和肥胖抵抗大鼠GS神经元兴奋性、胃动力、胃排空以及摄食活动调控,该效应可能是通过OX-1R信号通路而实现的;MC3/4R受体信号通路可能也参与了该过程的调控;Orexin-A上述调控效应在肥胖和肥胖抵抗大鼠更为显著,其可能与肥胖和肥胖抵抗大鼠LHA中OX-1R表达增加有关.