论文部分内容阅读
目的： 探讨17β-雌二醇（17β-estradiol,βE2）对过氧化氢（hydrogen peroxide, H2O2）诱导的视网膜色素上皮细胞（retinal pigmentalepithelium，RPE）细胞氧化损伤及蓝光LED灯照射诱导的SD大鼠视网膜损伤的保护作用途径及其相关的分子机制，为临床上治疗年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration，AMD）提供新的思路。 方法： （1）体外实验： ①体外培养人RPE细胞株ARPE-19细胞，用不同浓度（0μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM）H2O2处理ARPE-19细胞24h，采用CCK-8法检测细胞活性，确定 H2O2作用浓度； ②用不同浓度（0μM、1μM、10μM、40μM、60μM、80μM）βE2预处理30min后加入上述实验确定好浓度的H2O2处理ARPE-19细胞24，采用CCK-8法检测细胞活性，确定βE2作用浓度； ③DCFH-DA荧光探针检测 ARPE-19细胞活性氧（reactive oxygen species, ROS）水平的改变； ④Annexin V FITC-PI双染流式细胞法检测细胞凋亡变化，Western Blot法检测Akt磷酸化水平、凋亡相关因子Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase3蛋白表达水平； ⑤电镜检查自噬小体的数量变化； ⑥q-PCR及Western Blot法检测自噬相关因子Beclin1、LC3B或LC3-II/LC3-I mRNA及蛋白表达变化。 （2）体内实验： ①对去势SD大鼠行蓝光LED灯（460nm,3000lux）照射2h（9:00-11:00 am）后，HE染色检查视网膜厚度的变化，ERG检测视网膜功能的改变，评估蓝光LED灯照射SD大鼠视网膜损伤模型是否成功建立； ②在蓝光LED照射前用4μl,10μM的βE2注射大鼠玻璃体腔，HE染色检查视网膜厚度的变化，ERG检测视网膜功能的改变，评估βE2对蓝光LED灯照射SD大鼠视网膜损伤是否有保护作用； ③TUNEL法检测凋亡变化； ④免疫组化、Western Blot法检测Akt磷酸化水平、凋亡相关因子Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase3表达变化。 ⑤电镜检查自噬小体的数量变化； ⑥免疫组化、Western Blot法检测自噬相关因子Beclin1、LC3B或LC3-II/LC3-I的表达变化。 结果： （1）体外实验： ①H2O2最适作用浓度为40μM； ②βE2最适作用浓度为10μM； ③H2O2处理组ROS生成水平较正常对照组ROS生成水平增高；βE2预处理组ROS生成水平较 H2O2处理组 ROS生成水平降低。 ④H2O2处理组ARPE-19细胞凋亡相比正常对照组明显增加；βE2预处理组相比H2O2处理组凋亡降低。H2O2处理组Akt的磷酸化水平降低，凋亡相关因子Bcl-2降低，Bax、Cleaved Caspase3表达上升，βE2预处理组Akt的磷酸化水平升高，凋亡相关因子Bcl-2升高，Bax、Cleaved Caspase3表达下降； ⑤H2O2处理组自噬小体数量相比正常对照组增加，βE2预处理组自噬小体数量比H2O2处理组进一步升高； ⑥H2O2处理组自噬相关基因Beclin1和LC3B的mRNA水平表达比正常对照组升高，βE2预处理组自噬相关基因Beclin1和LC3B的mRNA水平表达比H2O2处理组进一步升高；H2O2处理组自噬相关因子Beclin1、LC3-II/ LC3-I的蛋白水平表达比正常对照组增加；βE2预处理组自噬相关因子Beclin1和LC3-II/LC3-I的蛋白水平表达比H2O2处理组进一步升高。 （2）体内实验： ①HE结果示，未经光照的去势及假去势大鼠视网膜结构层次分明，排列紧密，染色均匀，形态规则，与视网膜其他各层分界清楚。蓝光LED灯照射去势大鼠后视网膜结构较正常明显紊乱，连续层状结构消失，ONL厚度明显变薄；ERG结果示，蓝光LED灯照射去势及假去势大鼠组a波和b波振幅较去势对照组 a波和 b波振幅降低； ②βE2预处理组大鼠视网膜结较蓝光LED灯照射组视网膜结构清楚，排列紧密，ONL厚度明显增厚；βE2预处理组a波和b波振幅较蓝光LED灯照射组a波和b波振幅增加； ③蓝光LED灯照射组细胞凋亡相比正常对照组明显增加；βE2预处理组相比蓝光LED灯照射组凋亡降低； ④蓝光LED灯照射组Akt的磷酸化水平降低，凋亡相关因子Bcl-2降低，Bax、Cleaved Caspase3表达上升，βE2预处理组Akt的磷酸化水平升高，凋亡相关因子Bcl-2升高，Bax、Caspase-3表达下降； ⑤蓝光LED灯照射组自噬小体数量增加，βE2预处理组自噬小体数量进一步升高； ⑥免疫组化结果示，蓝光LED灯照射组较对照组自噬相关因子Beclin1和LC3B水平表达升高，βE2预处理组相比蓝光LED灯照射组自噬相关因子Beclin1和LC3B水平表达进一步升高；Western Blot实验结果示，蓝光LED灯照射组比对照组自噬相关因子Beclin1、LC3-II/LC3-I的蛋白水平表达增加；βE2预处理组比蓝光LED灯照射自噬相关因子Beclin1和LC3-II/LC3-I的蛋白水平表达进一步升高。 结论： （1）H2O2诱导的ARPE-19细胞氧化损伤模型及蓝光LED灯照射诱导的SD大鼠视网膜损伤模型成功建立。 （2）βE2对H2O2诱导的ARPE-19细胞氧化损伤及蓝光LED灯照射诱导的SD大鼠视网膜损伤有保护作用。 （3）βE2对H2O2诱导的ARPE-19细胞氧化损伤及蓝光LED灯照射诱导的SD大鼠视网膜损伤的保护作用可能通过减少细胞凋亡和增加自噬实现的。