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6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯是降胆固醇特效药他汀类药物的重要手性中间体,具有重要的应用价值。由于酶法不对称催化具有反应条件温和、转化率高及立体选择性好等优点,已经成了诸多手性合成方法的首选。本文在对羰基还原酶表达菌株E.coli BL21(DE3)-pET28a-cr3及葡萄糖脱氢酶表达菌株E.coli BL21(DE3)-pET28a-gdh4发酵条件优化的基础上,构建了双酶耦联体系以解决辅酶再生问题,并对上述重组菌耦联催化(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯还原反应的特性进行了研究。研究工作的主要内容包括:对羰基还原酶表达菌株E.coli BL21(DE3)-pET28a-cr3及葡萄糖脱氢酶表达菌株E.coli BL21(DE3)-pET28a-gdh4发酵条件进行了优化,确定最适的发酵条件,E.coliBL21(DE3)-pET28a-cr3为:种龄7 h,接种量3.0%,37 ℃发酵培养时间2 h,诱导剂乳糖终浓度9.0 g·L-1,28 ℃诱导9 h。在此条件下羰基还原酶比酶活达到2622.3 U·g-1,其生物量(DCW)为 3.6 g·L-1。E.coli BL21(DE3)-pET28a-gdh4 的最优培养条件为:种龄7 h,接种量4.0%,37 ℃发酵培养时间2 h,诱导剂乳糖终浓度9.0 g·L-1,28 ℃诱导9 h。为3410.4 U·g-1,其生物量(DCW)为3.5 g·L-1。选择羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶双酶耦联催化(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯不对称还原制备他汀药物关键手性合成子6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯。生物催化条件优化结果揭示,在不添加外源性辅酶NADP(H)、菌体用量15.0gDCW·L-1、147.0g·L-1(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯、128.2g·L-1葡萄糖,30.0℃、pH6.5条件下反应6.0 h后,底物转化率100.0%,产物d.e.值≥99.5%。采用冷冻干燥技术可以对菌体进行较长时间的保存,同时冻干细胞在进行催化时不再需要细胞破碎,也不需要外加辅酶(NADP+)。催化条件为:温度30.0 ℃,pH恒定为6.5,缓冲液K2HP04-KH2P04(100.0 mmol·L-1),(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯浓度147.0 g·L-1,辅助底物葡萄糖浓度 128.2 g·L-1,E.coli BL21(DE3)-pET28a-cr3 与E.coliBL21(DE3)-pET28a-gdh4质量比为2:1,菌体总浓度(干重,冻干细胞保存3周)15.0 g·L-1。在该条件下,反应7～8 h后结束,转化率 100.0%,d.e.≥99.5%。分别对有辅酶参与的羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶催化双底物的酶动力学性质进行研究,并从实验数据回归得到了动力学公式的常数,所得到的羰基还原酶(CR)葡萄糖脱氢酶(GDH)酶催化反应动力学方程可分别表示为:羰基还原酶的产物抑制实验验证了其反应机制为Ordered Bi-Bi反应机理,上述数学模型可以用于描述双酶耦联体系催化(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯还原为6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的过程。