江南卷柏,拉丁文名为SelaginellamoellendorfiiHieron,又名石柏,岩柏,黄疸卷柏,分布于中国南方大部分地区,长江以南的各个省份均有生长,为常绿草本植物,多年生,全年均可收取。江南卷柏能够清热利尿,活血消肿,可用于治疗包括急性传染性肝炎,血小板减少,全身浮肿等。江南卷柏提取物的制备方法有多种,分别为冷浸法,渗漉法,乙醇回流法等。已知江南卷柏主要的化学成分是黄酮类,其中穗花杉双黄酮含量最高。在蕨类植物中和裸子植物中,存在大量的黄酮单体化合物,尤其是在松柏纲,银杏纲和凤尾纲的植物中含量最多,而黄酮类具有广泛的药理活性,比如抗炎症,抗氧化,抗病毒,抗癌,舒张血管等,因此黄酮类化合物在国内外受到很大的重视,研究也比较多。皮肤是保护人体与外界有害环境隔绝的第一道防线。当人受到伤害过后,伤口会迅速止血,闭合,受损的皮肤会迅速再生,从而再次起到屏障作用。有效的皮肤伤口愈合需要很多种细胞参与,并且这一过程是在不同层面被精确的调控。伤口愈合的过程主要可以分为四个时期,包括止血期(在受损后数个小时之内),炎症期(受损后1-3天),增殖期(受损后4-21天),重塑期(受损后21天-1年)。在正常伤口愈合过程中,成纤维细胞具有重要作用,很多胞外基质成分,如胶原蛋白,纤维蛋白,纤连蛋白,蛋白聚糖以及葡萄氨基葡聚糖,都具有促进成纤维细胞存活,增殖,迁移的能力。在人类不同组织中,成纤维细胞的类群并不一样,并且在一个特定的组织中,也有明显的不同。例如在人皮肤真皮层中,在不同的皮肤层居住着不同类型的成纤维细胞类群,这些细胞具有各自独特的形态以及生理功能。结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF, CCN2)是CCN家族(CCN1-6)的一员。结缔组织生长因子的功能研究最开始是因为发现其在过量的胞外基质合成中具有重要作用,并与一些纤维化疾病相关。结缔组织生长因子在正常皮肤组织中并不经常表达,但是当皮肤受到损伤过后,结缔组织生长因子的表达会升高,并能促进成纤维细胞表达胶原蛋白Ⅰ,胶原蛋白Ⅲ,组织抑制因子MMP和基础的FGF,但是并不影响蛋白聚糖的表达。虽然结缔组织生长因子并不影响肌成纤维细胞的分化,但是它被认为具有促进间充质干细胞迁移到伤口并分化成表皮成纤维细胞的能力。另外,结缔组织生长因子能够通过整合素a5 β1促进角质细胞在伤口愈合过程中迁移到伤口处。江南卷柏具有止血消肿等诸多药效,本课题拟对江南卷柏全草进行水溶性成分和脂溶性成分提取,然后采用一系列分离提纯的方法纯化获得其有效成分,并对获得的组分进行结构分析,并分析其对皮肤伤口愈合的作用。江南卷柏水溶性成分提取采用热水浸提法,脂溶性成分提取采用乙醇回流法,粗提物通过大孔树脂吸附,RC 18硅胶柱和Sephadex LH-20进行分离,采用制备型HPLC进行最后的纯化制备。分离获得的化合物结构分析方法包括紫外吸收光谱,红外吸收光谱,核磁共振NMR分析,HPLC-ESI-MS,酸水解分析,旋光度测试,不饱和度分析等。提纯获得的化合物的功能主要通过体内体外的研究方法,分析其与皮肤伤口的愈合作用关系,体外研究包括测试其对NIH3T3增殖迁移的促进的效果,并通过荧光定量PCR,Western blot分析其作用机制,体内实验拟采用SD大鼠切割伤伤口愈合模型,测定江南卷柏纯化产物对SD大鼠皮肤伤口愈合的作用。本课题对江南卷柏脂溶性成分以及水溶性成分进行了提取分离：并成功分离提纯得到了两个化合物,水溶性提取物A和脂溶性提取物B。水溶性提取物A是一种黄色的不定形粉末。将江南卷柏全草去根过后,晒干,然后采用中药粉碎机充分粉碎然后称取15kg烘干过后的江南卷柏样品,采用95%乙醇进行回流脱脂过后,剩余残渣采用双蒸水进行浸提,采用100L双蒸水浸提三次,每次浸提4h,将提取液合并,采用旋转蒸发仪进行浓缩冻干后得到江南卷柏水溶性提物1552g。将水溶性提取物用热稀醇进行充分溶解,然后上样到D101型大孔树脂进行吸附,再采用不同浓度的乙醇进行梯度洗脱,收集洗脱液并进行浓缩,浓缩产物采用冷冻干燥机进行干燥,得到不同梯度的洗脱产物,其中60%乙醇洗脱得到的洗脱液浓缩干燥过后得到乙醇提取物521g。将乙醇提取物用双蒸水充分溶解,然后用RP C18硅胶柱吸附,采用不同比例甲醇与水进行洗脱,收集洗脱产物然后进行浓缩冷冻干燥,在甲醇与水比例为50：50的洗脱液到产物22.6g。将此产物用甲醇充分溶解,然后用制备型高效液相色谱仪进行制备,获得水溶性提取物A 25.2mg。脂溶性提取物B是白色不定形粉末。将江南卷柏全草去根晒干,采用中药粉碎机彻底粉碎烘干,称取15kg江南卷柏粉木样品,采用100L 95%乙醇进行回流三次,每次四小时,然后收集提取液,浓缩干燥过后称重,得到江南卷柏乙醇粗提物1223g。将乙醇粗提物采用石油醚进行脱脂,剩下的残渣经过晾干过后用乙酸乙酯进行充分溶解,然后用大孔树脂D101型吸附,采用乙酸乙酯进行洗脱,收集洗脱液,经过浓缩干燥过后获得乙酸乙酯提取物112.7g。将乙酸乙酯提取物上样到RP C18硅胶柱上,采用不同浓度的石油醚／乙酸乙酯混合物进行洗脱,分别收集各部分洗脱液,当石油醚与乙酸乙酯比例为1：6时,获得的组分质量为12.5g。将其用乙酸乙酯充分溶解过后,上样到Sephadex LH-20柱子上,通过不同浓度的甲醇进行洗脱,分步收集洗脱液进行浓缩干燥,在100%甲醇洗脱时候,获得提取物质量为2.2g,将此提取物用甲醇充分溶解,采用制备型高效液相色谱仪进行制备,获得脂溶性提取物B 30.3mg。对于江南卷柏水溶液提取物A和脂溶性提取物B,采用了一系列方法对这两个化合物进行了组成结构的分析,结果如下。江南卷柏水溶性提取物A分子量通过HPLC-ESI-MS测定为m/z 815.2252[M-H]-,并根据核磁共振的结果,推测其分子式为C35H43O22。红外光谱分析表明其具有芳香环,羟基与羰基,并且根据其在259nm和338nm处的紫外吸收峰,推测其具有黄酮醇骨架。化合物A酸水解过后经过HPLC测定,表明其具有D-葡萄糖残基和D-半乳糖残基,并且组成比例为2：1,再根据1HNMR和13C NMR结果,推断江南卷柏水溶性提取物A为黄酮苷类,其分子构型如下：7,3’-di-O-methylquercetin-4’-O-[β-galactosyl-(1→3)-β-glucoypranactosyl]-3-O-β-glucopyranoside江南卷柏脂溶性提取物B通过HPLC-ESI-MS分析表明其分子量约为m/z251.0933[M-H]-,再结合核磁共振的结果以及不饱和度测试结果,推测其分子式为C13H1605。化合物B能够与FeCl3-K3[Fe(CN]6]反应,并且根据其在红外吸收光谱3344,3252 cm-1的吸收峰,表明其具有酚羟基结构。其在232 and 291 nm的吸收峰以及在红外吸收光谱(1735,1612,1427,1358,866 cm-1)的吸收峰表明其具有芳香环并具有不饱和酮基团,再根据核磁共振氢谱与核磁共振碳谱的结果以及旋光度测试结果,推测江南卷柏脂溶性提取物B为异色满衍生物,其构型如下：(3 R)-5,6,7-trihydroxy-3-isopropyl-3-methylisochroman-1-one江南卷柏提取物可以用于治疗包括止血,吐血,便血,痔疮出血,烧伤烫伤等,所以推测其具对伤口愈合可能具有促进作用,所以通过体内体外实验对江南卷柏提取物对伤口的愈合作用进行研究,体外实验主要采用小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3作为研究模型,研究江南卷柏提取物A和B对NIH3T3的增殖,迁移等方面的作用,并分析其作用机制,体内实验主要采用SD大鼠切割伤伤口愈合模型测定纯化产物对伤口愈合的作用关系。通过体外实验研究发现,江南卷柏水溶性提取物A对小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3增殖,迁移的影响,并具有剂量依赖效应,在低浓度的时候增殖和迁移的促进效果(1uM)的时候,明显低于在高浓度(10uM)的时候的增殖和迁移的促进效果。另外与阳性对照硫酸皮肤素相比,江南卷柏水溶性提取物A的增殖和迁移的促进效果与其接近,表明江南卷柏的水溶性提取物具有良好的促进小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3增殖和迁移效应。另外通过荧光定量PCR的结果表明,江南卷柏水溶液提取物A能够促进小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3中CTGF基因mRNA的表达,其与江南卷柏水溶液提取物A的量成剂量相关,江南卷柏水溶液提取物A的浓度越高,其促进小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3的CTGF mRNA基因表达的量越高。与之相对应的,江南卷柏水溶性提取物A能够明显的促进CTGF蛋白的表达,其促进效果与江南卷柏水溶性提取物A的浓度相关,浓度越高,促进CTGF蛋白的表达的量越大。通过SD大鼠切割伤伤口愈合模型研究发现,与空白对照组相比,江南卷柏水溶液提取物A能够有效的促进伤口收缩愈合,上皮生成,通过石蜡切片染色观察,与空白对照组相比,江南卷柏水溶液提取物A处理过的伤口,成纤维细胞数量,血管数量以及胶原纤维的数量都明显的增多。这些结果表明,江南卷柏水溶液提取物A能够明显的促进SD大鼠切割伤伤口的愈合。综上所述,本课题从江南卷柏中提取物分离得到了两个新的化合物,水溶性化合物A和脂溶性化合物B,并通过一系列分析方法测定出其化学组成和分子结构,A为黄酮苷类衍生物,B为异色满类衍生物。同时对江南卷柏提取物A对皮肤伤口愈合的作用进行了研究,体外实验研究发现江南卷柏水溶液提取物A能够明显的促进NIH3T3增殖和迁移,并通过荧光定量PCR和western blot测定表明,江南卷柏水溶液提取物A能够增加NIH3T3结缔组织生长因子(CTGF) mRNA与蛋白表达量,另外通过SD大鼠切割伤伤口愈合模型研究发现,江南卷柏水溶液提取物A能够明显的促进皮肤伤口愈合。以上结果表明,江南卷柏水溶液提取物A具有促进皮肤伤口愈合的能力,具有潜在的开发利用价值。