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玉米褪绿斑驳病毒(Maize chlorotic mottle virus,MCMV)与甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)协同侵染可以引起玉米致死性坏死病(Maize Lethal Necrosis Disease,MLND);该病害近些年来流行爆发,成为玉米生产上的主要病毒病害之一,对生产造成了极大的危害。为研究MCMV与SCMV协同侵染导致MLND的分子机制以及为防治该病害提供指导,本研究分别从蛋白质组和病毒群体水平进行探索和研究。首先,我们用 iTRAQ(isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation)技术分别分析了玉米(B73)响应MCMV单独侵染以及和SCMV协同侵染引起MLND的相关寄主因子表达量变化。通过使用病毒诱导的基因沉默(Virus Induced Gene Silencing,VIGS)技术对若干差异表达蛋白进行了验证。iTRAQ共发现605个蛋白响应MCMV侵染,其中407个为上调表达,198个为下调表达。从中挑选20个进行转录水平分析,发现16个差异表达蛋白在蛋白水平与转录水平应答MCMV侵染的模式一致。KEGG pathway注释及富集分析发现核糖体和光合作用通路发生极显著富集。从差异表达蛋白中选择蛋白质二硫键异构酶PDIL1-1(protein disulfide isomeraselikeprotein 1-1)、过氧化物还原酶PRX5(peroxiredoxin5)和蔗糖合酶SUS1(sucrose synthase 1)进行进一步的研究。使用黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)诱导的玉米基因沉默系统成功使它们的表达量分别降低,然后摩擦接种MCMV。发现沉默PPDIL1-1和PRX5后MCMV的积累量受到显著抑制;同时MCMV侵染引起的症状也有所减轻。另一方面,研究发现沉默SUS1后对MCMV侵染B73没有显著影响。以MCMV单独侵染作为对照,MCMV和SCMV协同侵染共鉴定到723个差异表达蛋白。对所有的差异表达蛋白进行GO功能注释和富集分析,发现57个极显著富集的GO条目。对差异表达蛋白进行KEGG pathway注释及富集分析,发现有5个通路为极显著富集。在协同侵染诱发MLND的过程中TCA循环、γ-氨基丁酸代谢、植物激素等途径发生显著变化。两个与磷酸盐(phosphates,Pi)同化有关的蛋白在协同侵染时表达量发生显著上调,即玉米磷转运蛋白 ZmPHT3;3/4(Zea mays phosphate transporter 3;3/4)和玉米紫色酸性磷酸酶 ZmPAP(Zeamays purple acid phosphatase)。运用 CMV诱导的玉米基因沉默系统分别对它们进行沉默,并摩擦接种MCMV和SCMV,发现它们对协同侵染有着不同的影响。沉默ZmPHT3;3/4后协同侵染中MCMV和SMCV的积累量显著降低;而沉默ZmPAP后,协同侵染中MCMV和SMCV的积累量却显著提高。推测降低ZmPHT3;3/4的表达量可能会打破Pi在细胞内不同亚细胞结构中的分配平衡,从而诱导ZmPAP的表达;ZmPAP是MLND的负调控因子,过表达该蛋白能够抑制协同侵染病毒的积累。MCMV和SCMV除了通过调控影响寄主因子的表达进行协同作用外,病毒的基因组之间也存在相互作用。研究两个病毒在协同侵染选择压下病毒基因组的相互作用有助于更加深入地了解MCMV与SCMV协同作用的分子机制。本研究中我们使用高通量测序技术分别研究了 MCMV、SCMV单独侵染以及协同侵染时病毒群体的变异情况,提供了两种病毒在协同侵染压力下病毒群体的变异信息。通过对高质量二代测序结果进行病毒SNV(Single Nucleotide Variants)分析,发现第一代MCMV单独侵染时(M1)非编码区变异程度略高于编码区,MCMV单独连续传代至第九代(M9)后,SNVs在编码区和非编码区均匀分布。分别对协同侵染中MCMV和SCMV的变异情况进行统计,发现MCMV的变异程度在协同侵染时略有下降;SCMV的总体变异程度在协同侵染时显著下降。进一步分析SNVs碱基替换类型发现协同侵染和单独连续传代都造成MCMV中颠换(transversions)的比例有所增加,主要的颠换类型倾向性于T→G。MCMV和SCMV中发生频率最高的转换(transitions)类型都是A→G。SCMV单独侵染第一代(S1)和第九代(S9)中转换和颠换比例分别为3.3、3.9。选取变异频较大(>1%)的SNV热点进行进一步的统计和分析。发现在MCMV第一代、第九代以及与SCMV协同侵染第一代(MS1)和第九代(MS9)存在六个一致的SNV热点,但是在不同样品中突变频率有所不同,暗示这些位点是MCMV自身突变的热点。进一步分析发现,在第一代MCMV基因组中三个SNV热点在其单独摩擦传代过程或者协同侵染中都发生变化。单独摩擦MCMV传播到第九代后,发现有十个比较明显的SNV热点,其中五个热点位于P32 ORF内,造成P32蛋白中四个氨基酸的改变。在协同侵染摩擦传播至第九代后MCMV中存在七个SNV热点,值得注意的是位于P32 ORF内的三个SNVs都造成氨基酸的突变。无论是在单独侵染还是协同侵染中,P32 ORF都在连续传代过程中有比较大的变异,暗示该基因在实验处理下处于较大的选择压力下。研究发现,CP蛋白在MCMV编码的所有蛋白中是最保守的,所有位于CP ORF内的SNVs都没有造成氨基酸的改变;而3’UTR则是变异最高的区域。与MCMV相比,SCMV的3’UTR在协同侵染中趋向于变异程度降低;SCMV CP蛋白中的一些氨基酸在单独摩擦传代中也发生了变化,第一代S1中CP ORF内只有一个SNV热点,而在第九代S9中则有位五个SNV热点,这六个位点都造成CP蛋白氨基酸的改变。我们还发现,MS1中SCMVCPORF内有8631、9324位两个SNV热点;在MS9中只有8631位一个SNV热点。以上结果暗示在单独连续传代过程中SCMV的CP蛋白倾向于积累更多的变异,而在协同侵染中位于CP蛋白内的变异被有效抑制,这种差异可能与SCMV在自然界中的传播方式密切相关。病毒能够编码一个或多个RNA沉默抑制子来抑制植物的RNA沉默。本研究通过GFP瞬时表达系统发现MCMV编码的P7a、CP具有弱的抑制局部基因沉默的能力,进一步研究表明P7a、CP具有明显的抑制系统基因沉默和抑制系统沉默信号传导的能力。BiFC(Biomolecular Fluorescence Complementation)结果表明 P7a、CP 与 SGS3(Suppressor of Gene Silencing 3)存在互作关系。推测P7a、CP可能通过与SGS3互作结合,影响SGS3的功能,从而抑制基因沉默。