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目的小胶质细胞是中枢神经系统的常驻巨噬细胞,是中枢神经系统(CNS)的主要免疫防御系统。小胶质细胞具有吞噬功能,可以清除中枢神经系统内死亡的细胞或者细胞碎片。小胶质细胞具有丰富的受体诱导的钙信号,钙池操控钙内流(store operated calcium entry,SOCE)作为钙信号的组成部分已经在小胶质细胞被发现,但是我们对于钙池操控钙内流在小胶质细胞具有什么样的功能仍然知之甚少。我们的前期研究已经发现二磷酸尿苷(Uridine diphosphate,UDP)能够在小胶质细胞C8-B4细胞引起SOCE,而且这种SOCE介导了 UDP增加小胶质细胞胞吞的作用。本论文将继续研究UDP-P2Y受体-SOCE通路是通过何种机制促进了小胶质细胞的胞吞作用。方法1.探究小胶质细胞中P2Y6受体与SOCE的关系:1.1使用RT-PCR技术对C8-B4中可能存在的受体亚型进行扩增,探究P2Y受体亚型在C8-B4细胞中的存在情况。1.2在C8-B4细胞负载Fluo-4,利用共聚焦显微镜进行钙成像。使用P2Y6选择性激动剂5-OMe-UDP诱导SOCE。2.探究小胶质细胞中SOCE在改变C8-B4细胞F-肌动蛋白和细胞褶皱中的作用:2.1利用共聚焦显微镜对C8-B4细胞进行相差成像,观察细胞松弛素对细胞褶皱的影响。利用活细胞荧光成像观察LifeAct-GFP标记的F-肌动蛋白和相差成像,观察F-肌动蛋白和细胞褶皱之间的关系。2.2利用共聚焦显微镜对C8-B4细胞进行相差成像,在UDP抑制细胞褶皱后,观察移除胞外钙和2-APB是否反转UDP对细胞褶皱的影响。3.探究UDP诱导SOCE促进小胶质细胞胞吞的机制:3.1使用F-肌动蛋白阻断剂细胞松弛素对C8-B4细胞进行处理,利用pHrodo-Zymosan颗粒观察胞吞,观察细胞松弛素对C8-B4细胞胞吞的影响。3.2利用活细胞荧光成像同时观察LifeAct-GFP标记的F-肌动蛋白和pHrodo-Zymosan颗粒观察C8-B4细胞胞吞过程中F-肌动蛋白的动态变化。使用鬼笔环肽对F-肌动蛋白进行染色,观察在对照组、UDP处理组和阻断外钙组中Zymosan颗粒周围的F-肌动蛋白情况。结果1.P2Y6受体的激活可以诱导SOCE:1.1 C8-B4细胞存在P2Y6受体;1.2 P2Y6选择性激动剂5-OMe-UDP可以引起SOCE。2.UDP诱导的SOCE可以改变小胶质细胞的F-肌动蛋白状态:2.1细胞褶皱现象依赖于F-肌动蛋白;2.2 UDP对褶皱的作用以SOCE为基础。3.UDP诱导的SOCE通过影响F-肌动蛋白增强了胞吞作用:3.1小胶质细胞胞吞依赖于F-肌动蛋白的变化;3.2 UDP通过SOCE增加胞吞杯中F-肌动蛋白的聚拢。结论UDP在小胶质细胞激活P2Y6受体后,诱导钙池操控钙内流,内流的钙离子可以改变细胞内F-肌动蛋白的状态和抑制细胞褶皱现象。SOCE也抑制胞吞过程中的无效褶皱和促进胞吞杯中F-肌动蛋白的聚拢,从而增加小胶质细胞的胞吞。