目的:构建含人的肝细胞生长因子(Human hepatocyte growth factor)基因真核表达载体pEGFP-N1-HGF,探讨其在体外培养人的成纤维细胞的转染与表达,为其在体内应用提供实验依据。方法: RT-PCR扩增人的间充质干细胞中hHGF全长cDNA片段,克隆入pEGFP-N1真核表达载体中,获得pEGFP-N1-HGF重组质粒。应用脂质体技术以绿色荧光蛋白(GFP)作为报告基因,采用脂质体Lipofectamine 2000包裹pEGFP-N1-HGF重组质粒转染到人的皮肤成纤维细胞中,研究了细胞接种密度、DNA用量、脂质体与DNA的比例等因素对脂质体转染效率的影响,获得表达克隆。采用荧光显微镜观察、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白质印记方法(Western Blotting)鉴定和ELISA方法定性和定量的测定hHGF的表达。结果: 1.质粒酶切鉴定结果:提取的质粒经双酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定后可得到4660bp和2200bp两个片段,与原质粒图谱符合,表明所提取的质粒为重组pEGFP- N1- HGF。2.人的皮肤成纤维细胞经2-5次传代后转染重组质粒pEGFP- N1- HGF后,荧光显微镜下观察到细胞内发出绿色荧光,在细胞接种密度为2×10~5、0.8ugDNA用量、2.5:1的脂质体与DNA比例时,转染效率最高分别为22.73±0.44%、21.88±0.34%、22.29±0.42%。3.转染后细胞提取总RNA后经过RT-PCR能扩增HGF cDNA预期的756 bp片段,证实转染质粒在成纤维细胞内有转录,Western blotting证实转染HGF基因在成纤维细胞内有HGF蛋白的表达,同时通过ELISA法检测转染细胞的上清液,表明转染成纤维细胞中有分泌,其分泌量为(5.9～7.55 ng/ 8×10~5 cells)。结论:成功构建重组质粒pEGFP-N1-HGF,并证实其能够在成纤维细胞中转录与表达分泌,提示我们构建的成纤维细胞模型能够替代毛乳头细胞分泌肝细胞生长因子的功能,为脱发疾病的基因治疗提供依据。