背景帕金森病(Parkinson’s Disease,PD)是一种常见的神经退行性疾病,多发于50-60岁的中老年人,其典型的病理学特征为中脑黑质致密区多巴胺能神经元变性、缺失及Lewy小体的形成,其发病机制尚不明确。神经调节蛋白1(Neuregulin1,NRG1)在神经元中主要通过激活ErbB家族的受体酪氨酸激酶ErbB4进行一系列信号传导,从而在神经发育过程和神经元细胞功能中发挥重要作用,与许多神经系统疾病的发生发展密切相关。人参皂苷Rg1具有抗神经细胞凋亡和保护神经元的作用,可以改善PD的症状,但是其作用的分子机制有待进一步研究。目的观察人参皂苷Rg1对PD小鼠模型中脑黑质多巴胺能神经元中NRG1和ErbB4表达及活性的影响,探讨MPTP诱导PD的分子机制,寻找预防和治疗PD的新靶点。方法1.实验分组:将40只C57BL/6小鼠随机分为生理盐水对照组、MPTP模型组、MPTP+人参皂苷Rg1组、MPTP+人参皂苷Rg1+H89组。2.模型制备:生理盐水对照组和MPTP模型组小鼠腹腔注射0.9%生理盐水(1ml/kg/d),MPTP+人参皂苷Rg1组和MPTP+人参皂苷Rg1+H89组小鼠腹腔注射人参皂苷Rg1(10mg/kg/d),连续3天。第4天,生理盐水对照组继续腹腔注射生理盐水(1ml/kg),MPTP模型组,MPTP+人参皂苷Rg1组和MPTP+人参皂苷Rg1+H89组给予腹腔注射MPTP(20mg/kg),连续注射4次,每次间隔2小时。MPTP+人参皂苷Rg1+H89组在首次注射MPTP前30分钟腹腔注射一次H89(1mg/kg)。3.游泳实验:根据游泳实验评分标准,对各组小鼠在不同时间点游泳时肢体的协调能力做出评分,评价各组小鼠的行为学变化。4.病理形态学观察:HE染色,光镜下观察小鼠黑质区多巴胺能神经元形态及数量的变化。5.RT-PCR法:检测黑质中NRG1与ErbB4 mRNA的表达变化。6.Western印迹法:检测ErbB4和其磷酸化p-ErbB4的蛋白表达变化。结果1.一般行为学变化MPTP模型组小鼠在第2次注射MPTP后一小时内出现不同程度的竖毛、翘尾、打转等症状,在4次MPTP注射完后,小鼠出现肌肉震颤,尾巴僵直,步态不稳,行动减少等症状,24h后,上述症状基本消失;MPTP+人参皂苷Rg1+H89组在给予H89和MPTP注射后,也出现了不同程度的竖毛、翘尾、肌肉震颤、步态蹒跚等症状,而MPTP+人参皂苷Rg1组与这两组相比,上述症状明显出现的晚且轻,生理盐水对照组小鼠行为正常,未出现上述症状。2.游泳实验MPTP模型组小鼠在不同时间点的游泳实验分值均显著低于生理盐水对照组(P<0.05);MPTP+人参皂苷Rg1组小鼠的游泳实验分值均显著高于模型组(P<0.05);MPTP+人参皂苷Rg1+H89组与MPTP+人参皂苷Rg1组相比,游泳实验分值均降低(P<0.05);而MPTP+人参皂苷Rg1+H89组与MPTP模型组相比,均无显著性差异(P>0.05)。3.小鼠中脑黑质多巴胺能神经元病理形态学变化光镜下可见,与生理盐水对照组相比,MPTP模型组黑质多巴胺能神经元的轴突变短,数量变少。MPTP模型组的黑质多巴胺能神经元数量(32.461±1.170)显著低于生理盐水对照组(40.334±0.845,t=-13.452,P=0.000);MPTP+人参皂苷Rg1组的黑质多巴胺能神经元数量(35.925±0.681)显著高于模型组(t=-7.23,P=0.003);MPTP+人参皂苷Rg1+H89组的黑质多巴胺能神经元数量(33.648±0.966)显著低于MPTP+人参皂苷Rg1组(t=3.230,P=0.008);MPTP+人参皂苷Rg1+H89组与MPTP模型组相比,无显著性差异(t=2.274,P=0.892)。方差分析表明组间差异有统计学意义(F=41.234,P=0.000)。4.RT-PCR MPTP模型组的Nrg1 mRNA表达水平(0.460±0.1704)显著低于生理盐水对照组(1.000±0.0000,t=6.339,P=0.0079);MPTP+人参皂苷Rg1组Nrg1 mRNA表达水平(0.925±0.1681)显著高于MPTP模型组(t=3.199,P=0.0494);MPTP+人参皂苷Rg1+H89组Nrg1 mRNA的表达水平(0.648±0.1967)与MPTP+人参皂苷Rg1组相比,显著下降(t=1.916,P=0.0499);Nrg1 mRNA在MPTP+Rg1+H89组与MPTP模型的表达无显著性差异(t=1.134,P=0.3391)。方差分析表明组间差异有统计学意义(F=8.023 0,P=0.0211)。Nrg1-type I/II mRNA在MPTP模型组(0.376±0.1201)的表达水平显著低于生理盐水对照组(1.000±0.0000,t=10.400,P=0.0019);MPTP+人参皂苷Rg1组Nrg1-type I/II mRNA表达水平(0.766±0.1382)显著高于MPTP模型组(t=3.377,P=0.0432);MPTP+人参皂苷Rg1+H89组(0.310±0.2898)与MPTP+人参皂苷Rg1组相比,Nrg1-type I/II mRNA表达下降(t=3.150,P=0.0513);MPTP+人参皂苷Rg1+H89组与MPTP模型组相比,Nrg1-type I/II mRNA表达水平无显著性差异(t=0.3319,P=0.7618)。方差分析表明组间差异有统计学意义(F=12.46,P=0.0187)。Nrg1-type III mRNA在MPTP+人参皂苷Rg1组的表达水平(1.121±0.1812)显著高于MPTP模型组(t=3.419,P=0.0419)。5.Western blot方差分析表明,各组小鼠中脑黑质内ErbB4总的蛋白表达水平没有显著性差异(F=0.1578,P=0.8005)。MPTP模型组磷酸化ErbB4蛋白的表达水平(0.339±0.1339)显著低于生理盐水对照组(1.000±0.0000,t=8.548,P=0.0134);MPTP+人参皂苷Rg1组磷酸化ErbB4蛋白的表达水平(0.782±0.1369)显著高于MPTP模型组(t=6.986,P=0.0199);MPTP+人参皂苷Rg1+H89组磷酸化ErbB4蛋白的表达水平(0.365±0.2677)显著低于MPTP+人参皂苷Rg1组(t=4.407,P=0.0478)。方差分析表明组间差异有统计学意义(F=17.04,P=0.0282)。结论1.MPTP可能通过降低NRG1及其受体ErbB4的表达及活性诱导C57BL/6小鼠发生PD。2.人参皂苷Rg1可能通过激活小鼠中脑黑质NRG1/ErbB4的活性而改善其PD症状。