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一、研究背景癌症已成为全世界每个地区发病率和死亡率的重要原因,严重威胁着人类的健康。其中,肺癌的发病率和死亡率仍占第一位,呈逐年上升趋势。随着肿瘤免疫学的不断发展,肿瘤的免疫治疗成为继分子靶向治疗之后的新热点,其中PD-1/PD-L1信号途径为近年来肿瘤免疫治疗的研究热点之一,其阻滞剂抗PD-1、抗PD-L1抗体可以通过阻断负性免疫调节信号,逆转肿瘤逃逸从而杀伤肿瘤,临床上已证实其对多种瘤种显示出较好的疗效。尤其以PD-L1显示出重要临床意义。目前PD-L1的检测方式仍以组织IHC为主,但组织检测存在着肿瘤的组织标本采集困难、有创、可能带来医源性种植转移等缺点,那么,能否找到一种简单、有效、无创的方法检测PD-L1的表达呢?既往研究结果显示出肿瘤组织中PD-L1的mRNA水平与蛋白水平的一致性,进而推测血浆中PD-L1的mRNA水平可能可以代表肿瘤组织中PD-L1 mRNA的表达水平。实时荧光定量PCR法(Quantitative real-time PCR,RT-qPCR)作为核酸定量检测的重要方法之一,有着广泛的应用,并具有显著的优势。但由于实验过程中各个步骤存在不同的效率,且受到起始样品量、模版本身质量等因素的影响,反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数(CT值)无法真实反应样品中模板的绝对量,因此我们需要稳定表达的参照基因将不同样品的起始量标准化。目前,在组织和细胞中,常用β-actin、GAPDH、U6作为内参照,但血浆中基因检测尚无标准参照物。因此,我们拟自行设计一种用于血浆中核酸含量测定的外参照,并将其命名为PLACON。通过将外参照PLACON和内参照β-actin、GAPDH、U6在血浆样品及癌细胞株培养上清液中进行对比分析,验证其用于核酸检测更具优势性。进一步探索血浆中PD-L1的mRNA同组织中PD-L1蛋白水平是否具有一致性,及其同疗效、临床特征的关系。二、研究目的验证血浆中PD-L1的mRNA同组织中PD-L1蛋白水平是否具有一致性,探索血浆中PD-L1的mRNA水平同免疫治疗疗效、临床特征的关系。三、研究方法1、从与人类种属基因组相似性相距甚远的低级别物种秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans,T27E9.1d.39)的基因组选取外参照序列(PLACON)。利用正向引物(5’-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’)及反向引物(5’-CGACTCTACAACGACCGTGA-3’)进行PCR扩增筛选出PLACON序列:5’-cucgcuaacgacucuacaacgaccgugaauucaag cgccgcuuggauguccgc-3’。其碱基数为53、GC含量为56.6%、Tm值为87.1℃。利用在线工具BLAST进行序列相似性检索(网址:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。2、通过RT-qPCR法将外参照和内参照β-actin、GAPDH、U6在肺癌患者血浆样品及其细胞株培养上清液中在miRNA、mRNA水平进行对比分析,验证外参照(PLACON)用于核酸检测更具优势性。3、收集不同瘤种的恶性肿瘤患者的肿瘤组织和对应的血浆标本及其临床特征,采集肿瘤患者免疫治疗前血浆样本及免疫治疗2月血浆样本,将PFS、OS、bOR作为疗效评价指标。通过IHC方法检测患者组织中PD-L1(tPD-L1,tissue PD-L1)蛋白表达水平和qRT-PCR法检测血浆PD-L1 mRNA表达水平。探索组织中PD-L1蛋白表达水平同血浆PD-L1 mRNA表达水平是否具有一致性,并分析PD-L1 mRNA表达同免疫治疗疗效、临床特征的相关性。四、研究结果1、外参照PLACON序列具备完全的特异性,符合理想的外参照标准,RT-qPCR法可以检测血浆中PLACON的表达且具有较高的特异性。2、分别将PLACON稀释成10倍梯度浓度(0.005、0.05、0.5、5、50 ng/ml),使用RT-qPCR法获得血浆mRNA水平外参照CT值(n=,8),依次为23.57±0.29、21.36±1.22、17.14±0.66、10.70±0.36、6.95±0.27,PLACON浓度和CT值呈明显的线性关系,显示出PLACON在血浆中扩增的稳定性。PLACON浓度为0.5 ng/ml时,PLACON、β-actin、GAPDH组间CT值极差分别为2.87、8.36、6.44,PLACON组极差最小,波动范围小,提示PLACON在血浆mRNA水平中扩增的稳定性高于β-actin、GAPDH。3、用RT-qPCR法获得血浆miRNA水平PLACON同U6在恶性肿瘤患者血浆标本中的CT值,PLACON的CT值(16.20±0.93)显著低于U6组(19.49±1.01),差异具有统计学意。PLACON、U6组间CT值极差分别为3.01、2.95,PLACON同U6极差无明显区别,波动范围均较小。虽然PLACON同U6的极差无明显差异,但PLACON扩增效率较U6高,仍具有一定扩增优势。4、分别将PLACON稀释成10倍梯度浓度(0.005、0.05、0.5、5 ng/ml),使用RT-qPCR法获得细胞上清液PLACON的CT值(n=6),依次为23.99±0.24、17.95±0.20、15.83±0.07、7.86±0.24,PLACON浓度和CT值呈明显的线性关系,显示出PLACON在细胞上清液中扩增的稳定性、特异性和抗干扰性。PLACON、GAPDH、β-actin组间CT值极差分别为3.42、8.02、7.76,PLACON组极差仍为最小,稳定性最高。5、通过IHC检测组织中PD-L1蛋白水平同RT-qPCR法得到的血浆中PD-L1mRNA表达存在中度相关性(r=0.62,P<0.001);提示血浆中PD-L1mRNA可以代表组织PD-L1蛋白表达水平,可能成为预测疗效及指导治疗的生物标志物。6、采集51例患者的年龄、性别、是否吸烟、原发肿瘤类型、是否转移,上述临床特征与血浆中PD-L1mRNA表达均无显著相关性。7、接受免疫治疗的21例患者,治疗2个月和治疗前(基线水平)测得血浆PD-L1mRNA增加倍数超过2.03倍(n=11)的患者比增加倍数不到2.03倍(n=10)的患者有更好的无进展生存期(PFS)、总生存期(OS),这些患者也有更高的最佳总疗效(bOR)比例(45.45%VS7.69%)。五、结论1、外参照PLACON在血浆中扩增表达较内参照基因GAPDH、β-actin、U6具有可重复性、均一性、稳定性及高表达性等显著优势,更适合作为核酸检测的外参照;2、外参照PLACON在细胞上清中扩增表达较内参照基因GAPDH、β-actin具有可重复性、均一性、稳定性及高表达性等显著优势,更适合作为核酸检测的外参照;3、组织中PD-L1蛋白水平同血浆中PD-L1mRNA表达存在显著相关性;4、组织中PD-L1蛋白及血浆中PD-L1mRNA表达同临床病理特征无显著相关性;5、免疫治疗2月同免疫治疗前(基线水平)比较,血浆PD-L1 mRNA增加超过2.03倍较不到2.03倍的患者,有更好的PFS、OS及更高的bOR比例;