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H9亚型禽流感严重危害我国养禽业的发展。为了防治H9亚型禽流感,我国已经研发了至少15种H9亚型禽流感种毒的禽流感疫苗。这些疫苗均为灭活疫苗,只能产生血液循环抗体,几乎无法激活机体产生粘膜免疫和细胞免疫应答。由于禽流感病毒的变异性,在大面积使用流感疫苗时,流感病毒通过变异和重组逃逸宿主免疫压力,而产生新的变异株。原有的H9亚型禽流感灭活疫苗对这些新的变异株无法提供有效的免疫保护,导致临床中的新疫情或者隐性感染等。提高禽流感疫苗的保护效力,拓宽保护谱,成为禽流感疫苗研发的重点。常规筛选疫苗毒株的研发思路,导致研发过程漫长,不能针对不断出现的新的变异株。免疫增强剂的使用能够提高体液免疫和细胞免疫,提高疫苗免疫效力。我们在前期研究中已经获得VA5免疫增强剂能提高现有禽用灭活疫苗的免疫保护效力,包括体液免疫和细胞免疫。本研究初步探索该免疫增强剂提高H9亚型禽流感灭活疫苗粘膜免疫和细胞免疫的机理。1免疫增强剂对H9亚型禽流感灭活苗粘膜免疫分泌液中IgA、IgG含量的影响实验方法:75只SPF雏鸡随机分为3组:接种H9+VA5混合疫苗组(H9-VA5组)25只,接种H9疫苗组(H9组)25只,健康对照组(C组)25只。颈部皮下注射0.5mL/只,C组不做任何处理对照。3组鸡分别在免疫后第3、7、14、21天,各随机抽取3只鸡,经称重后,采集泪液、血液用于后续抗体检测。采集喉气管粘液,肠粘膜刮取液,肺脏冲洗液,迅速置低温保存,亦用作抗体检测。实验结果:免疫增强剂VA5明显提高了禽流感H9亚型灭活疫苗的HI抗体效价,约为21og2个HI效价。为了进一步评价免疫增强剂对于H9亚型禽流感灭活疫苗保护效力的提高,我们用iELISA的检测方法测定H9+VA5组、H9组、C组,第3、7、14、21天的血清、泪液、肺脏冲洗液、肠粘膜刮取液、喉气管粘液中的IgG、IgA抗体含量。血液中IgG抗体于免疫后第21天达到较高水平,IgA水平较低。IgA、IgG抗体水平随时间而提高,免疫后第21天,IgA含量:H9+VA5组>H9组>C组;IgG含量:H9+VA5组>H9组>C组。各黏膜抗体免疫后第21天IgA含量:H9+VA5组>H9组>C组;IgG含量:H9+VA5组>H9组>C组,说明免疫增强剂可以明显增强黏膜抗体IgA的分泌。用异源毒株进行攻毒保护试验,H9+VA5组保护率为100%,且存活鸡泄殖腔拭子和喉拭子检测未出现排毒情况。2免疫增强剂对鸡体分泌粘膜抗体细胞的动态影响实验方法:75只SPF雏鸡随机分为3组:接种H9+VA5混合疫苗组(H9-VA5组)25只,接种H9疫苗组(H9组)25只,健康对照组(C组)25只。颈部皮下注射0.5mL/只,C组不做任何处理对照。3组鸡分别在免疫后第3、7、14、21天,各随机抽取3只鸡,经称重后,采集肺脏、脾脏、盲肠淋巴结、法式囊用于检测。实验结果:在整个免疫期内,免疫组H9+VA5组,随着时间的递进,分泌IgA与IgG的B细胞呈递增趋势,第21天最多,且分泌IgA与IgG的B细胞位置基本相似。免疫组H9组,随着时间的递进,分泌IgA与IgG的B细胞也呈递增趋势,但分泌B细胞数量上少于H9+VA5组,C组对照组,随着时间的递进,分泌IgA与IgG的B细胞基本无变化,数量上远少于H9+VA5组和H9组。脾脏较之法氏囊、肺脏、盲肠淋巴结效果更为明显。实验结果表明,VA5免疫增强剂增强H9亚型灭活疫苗免疫效力,是通过增加分泌IgA细胞的数量达到的,分泌IgA与IgG的B细胞的位置基本相似。3免疫增强剂对H9亚型灭活苗CTL的影响实验方法:75只SPF雏鸡随机分为3组:接种H9+VA5混合疫苗组(H9-VA5组)25只,接种H9疫苗组(Re组)25只,健康对照组(C组)25只。颈部皮下注射0.5mL/只,C组不做任何处理对照。分离外周血淋巴细胞作为效应细胞,H9病毒感染的DF-1细胞作为靶细胞,效应细胞与靶细胞的比例为25、50、100、200。实验结果:H9+VA5组随着效应细胞与靶细胞的比例增大,杀伤率呈递增趋势,效应细胞与靶细胞比例在200:1时达到最大。H9组随着效应细胞与靶细胞的比例增大,杀伤率增高不显著。空白对照组杀伤率基本为0。H9+VA5组与H9组对比,在同一效应细胞与靶细胞比例,H9+VA5组的杀伤率远高于H9组。综上所述:免疫增强剂通过提高分泌IgA细胞的数量,从而提高粘膜抗体IgA的水平,同时通过促进CTL应答,来提高H9亚型灭活苗的免疫保护力。