研究背景卵巢癌是妇科常见的恶性肿瘤,因其高度侵袭性、较差预后的特点,严重威胁妇女健康,致死率居各类妇科肿瘤之首。由于其起病隐匿,组织结构和内分泌功能较复杂,临床症状不典型,缺乏特异的体征,大部分患者在得到诊断时已处于晚期或转移时期。然而卵巢癌的相关致病机制尚未阐明,因此发现新的肿瘤标志物能够对早期诊断和治疗提供更有效的信息,也可有效评估患者预后,具有重大意义。ENKUR基因位于染色体10p12.1,由8个外显子组成,长3378bp,编码产物相对分子量为29kDa。2004年在研究精子中TRPC(瞬时型感受器电位)通道活性和Ca2+偶联机制时,首次通过酵母双杂交筛选鉴定,并发现该基因高水平表达于睾丸和犁鼻器中,而在其它组织中,其表达水平相对较低。此外,还发现该基因主要通过与多种TRPC蛋白相互作用,从而调控精子中Ca2+通道活性。目前已知ENKUR编码蛋白含有三个结构域,包括C末端区可以与通路相互作用；与IQ模体结合的Ca2+感受器；富含脯氨酸的N末端与结构域SH3非共价结合。本实验组在研究鼻咽癌时,通过酵母双杂交实验筛选得出在鼻咽癌中ENKUR为NESG1相互作用基因之一。已有研究表明,NESG1可能是一个肿瘤抑制的相关基因,已经被证实在鼻咽癌中具有抑制生长,阻滞细胞周期G1期向S期发展,降低体外迁移侵袭能力的作用。由于肿瘤的发生大多涉及多种基因间相互作用,所以本实验组提出假设：ENKUR可能会如同NESG1影响肿瘤的致病过程。迄今为止还没有关于ENKUR在肿瘤方面的任何研究报道,我们课题组已通过实验证明ENKUR对鼻咽癌、肺癌和大肠癌致病过程产生影响。前期研究中,我们运用Western Blot和荧光定量PCR法检测出在卵巢癌组织和正常卵巢上皮组织中,ENKUR表达量差异显著：在卵巢癌组织中,ENKUR表达量下调。因此我们推测ENKUR基因在卵巢癌中可能作为候选抑癌因子。因此我们将首次对ENKUR在卵巢癌中的功能及机制进行初步探讨。细胞的生长、发育、衰老和死亡是细胞的基本生命活动,为了维持和延续生物体的生命活动,细胞必须通过分裂的方式进行自我复制和增殖,这个周而复始、循环往复的复制过程就是细胞周期(cell cycle)。细胞周期的调控受外源性和内源性调控影响。外源性调控主要指细胞受外界刺激引发的系列变化。内源性调控主要是蛋白质和酶类相互作用的复杂过程。细胞周期的调控机制是高度有序、严密精确的,如果细胞增殖失去严格控制会导致细胞遗传的不稳定性,这也是细胞发生恶变的重要原因,因此肿瘤性疾病也被称为“细胞周期病”。因此对细胞周期调控机制的研究,对认识肿瘤发生发展、临床诊断和预后具有很重要的意义。肿瘤的侵袭.转移是一个极其复杂的多步骤过程。有研究表明,上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是上皮细胞获得迁移能力的有效方式,在多种上皮细胞癌浸润转移过程中有着举足轻重的作用。上皮细胞发生EMT后,获得了间充质细胞的表型,拥有了较强的迁移和侵袭转移能力并产生了大量ECM成分。同时,表达间充质细胞特异的分子标志物,如Vimentin、FSP1、 desmin等存在于这些细胞,它们首先突破基膜,成为侵袭转移进程中的最前线,细胞黏附分子(如E-Cadherin)表达下调也更容易促进EMT的发生发展。发生EMT的肿瘤细胞定居到远处,在新的环境下,经过各种遗传和化学因素刺激,继续增殖生长,最终形成与原发肿瘤部位形态结构相似的转移瘤。因此,探索肿瘤微环境中存在的EMT诱因,寻找调控EMT的关键分子标志物,明确其在肿瘤发生、发展、转移中的病理意义是肿瘤转移机制研究的关键一环。卵巢癌的形成涉及多个基因和多条信号通路的改变,以及它们之间相互作用的失衡,调节细胞周期和侵袭转移的相关基因表达异常和相关通路的异常调控可能在卵巢癌的致病过程中起了重要的作用。因此,研究与卵巢癌相关的重要基因及其介导的信号通路的作用机制将有助于进一步揭示卵巢癌的致病机理,更好地预防和治疗卵巢恶性肿瘤。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路是一个经典的信号转导途径,此信号通路可以促进细胞的生长与增殖,诱发肿瘤细胞的迁移游走运动,参与细胞功能的多种调节,它的异常激活对肿瘤的发生和发展过程有着重要影响。多种生长因子和信号传导复合物收到细胞信号后被激活,然后活化PI3K.PI3K活化的第二信使PIP3间接使AKT磷酸化,从而引起完全活化的AKT通过磷酸化下游底物分子启动一系列级联效应,调节细胞增殖、生长和迁移等活动。经由Ras突变体介导的PI3K-Akt通路的活化从而诱导EMT的发生。PI3K/Akt的激活是EMT在肿瘤发展中的一个重要特征,造成E-Cadherin表达的缺失诱导EMT从而促进肿瘤转移。PI3K/Akt通路在肿瘤细胞的黏附、侵袭和转移中发挥重要作用。总之,PI3K/AKT通路可促进细胞生存并维持细胞正常功能,且在肿瘤细胞恶性增殖、血管生成和侵袭转移等多方面起着重要作用。迄今为止,关于ENKUR研究极少,在肿瘤研究中还未见任何报道,而我们关于ENKUR在卵巢癌中功能及机制的初步探讨将为研究者明确该基因在其他肿瘤中的功能提供重要的参考依据和研究思路。研究目的1、研究ENKUR在卵巢癌组织中的表达特性；2、研究ENKUR对卵巢癌细胞增殖的影响；3、研究ENKUR对卵巢癌细胞侵袭转移能力的影响。研究内容和方法1、ENKUR在卵巢癌组织中表达特性的鉴定利用Western Blot和荧光定量PCR分别检测卵巢癌组织和正常卵巢上皮组织中ENKUR的表达情况。2、过表达ENKUR的稳定细胞株建立利用慢病毒感染卵巢癌细胞株OVCAR-3和SK-OV-3,建立稳定过表达ENKUR的卵巢癌细胞株,以空载病毒作为对照；采用Western Blot鉴定过表达效率,筛选出稳定过表达ENKUR基因的卵巢癌细胞进行后续实验。同时利用RNA干扰技术,瞬时转染技术,利用Western Blot检测干扰效率并选择最佳干扰片段进行干扰ENKUR表达。2、ENKUR对于卵巢癌细胞增殖的影响1)MTT体外增殖实验分别检测过表达ENKUR和干扰ENKUR表达后卵巢癌细胞增殖的变化；2)平板克隆实验检测过表达ENKUR后,卵巢癌细胞增殖的变化；3)EDU细胞增殖实验检测过表达ENKUR后,卵巢癌细胞中处于S期的细胞比例的变化；4)流式细胞仪检测过表达ENKUR后,卵巢癌细胞周期的分布变化；5)稳定过表达ENKUR后,利用裸鼠皮下成瘤实验检测细胞体外成瘤能力的变化。6) Western Blot检测过表达ENKUR后的卵巢癌细胞周期相关蛋白表达情况的改变,从而探究ENKUR究竟通过哪些信号通路来调控卵巢癌的周期变化；3、ENKUR对于卵巢癌细胞迁移、侵袭和转移的影响1)卵巢癌细胞稳定过表达ENKUR和干扰ENKUR表达后,Transwell和Boyden细胞体外迁移侵袭实验分别检测过表达组和对照组细胞迁移和侵袭能力的变化；2) Wester Blot实验检测过表达ENKUR后的卵巢癌细胞EMT相关蛋白表达的改变,从而探究ENKUR究竟通过哪些信号通路调控卵巢癌细胞的迁移、侵袭和转移运动。4、统计学分析采用SPSS 21.0统计软件进行数据分析。计量资料结果用x±s表示。独立样本t检验空白对照组和目的实验组间的差异；析因方差设计分析MTT体外增殖实验和裸鼠皮下成瘤实验,不同处理组差异显著后再采用两独立样本t检验检测空白对照组和目的实验组间的差异。以双侧P<0.05为差异具有统计学意义。结果1、Western Blot和荧光定量PCR结果显示,ENKUR在卵巢癌组织中低表达,在正常卵巢上皮组织中高表达,两者差异显著具有统计学意义。 (t=9.500,P<0.001)2、慢病毒感染SK-OV-3和OVCAR-3细胞后,建立了稳定过表达ENKUR细胞株,Western Blot实验表明实现了ENKUR上调的过表达,可利用于后续实验。利用瞬转技术,Western Blot检测干扰效率后,选择干扰效率高的片段用来干扰掉过表达的ENKUR。SK-OV-3选取A片段,OVCAR-3选取C片段,用作后续实验。3、ENKUR在卵巢癌中抑制癌细胞的增殖及其分子机制1)MTT体外增殖实验分别检测过表达组和对照组中细胞增殖的变化,结果表明过表达ENKUR基因组细胞的生长速度明显减慢,两组差异显著,具有统计意义(OVCAR-3:F=64.218, P<0.001; SK-OV-3:F=72.135, P<0.001);同时检测干扰组和对照组细胞增殖变化,结果表明干扰ENKUR表达后卵巢癌细胞的生长速度明显增强,两组差异显著,差异有统计学意义(OVCAR-3:F=21.009, P<0.001; SK-OV-3:F=26.169, P<0.001);2)平板克隆实验检测过表达ENKUR后,卵巢癌细胞的克隆能力变化,结果表明过表达ENKUR基因后,细胞的克隆能力减弱,两组差异显著,具有统计意义(OVCAR-3:t=56.588,P<0.001, SK-OV-3:t=49.053,P<0.001);3)EDU细胞增殖实验表明,稳定过表达ENKUR基因后,卵巢癌细胞中,处于G1期的细胞比例上升,S期的比例下降(OVCAR-3:t=4.660,P=0.01; SK-OV-3:t=8.510,P=0.001),细胞被阻滞在分裂间期。两组差异显著,具有统计意义；4)细胞周期实验表明,过表达组的卵巢癌细胞处于G1期的细胞比例上升(OVCAR-3:t=7.695,P=0.002；SK.OV-3:t=19.251,P<0.001),S期的比例下降(OVCAR-3:t=2.951,P=0.042;SK-OV-3:t=21.943,P=0.001),细胞增殖能力下降。两组差异显著,具有统计意义；5)裸鼠体内成瘤实验结果表明,过表达ENKUR基因后,卵巢癌细胞在裸鼠皮下成瘤的重量和体积均减小,与空白对照组相比,两组实验结果在统计学上差异显著(OVCAR-3:F=32.33,P<0.001:SK-OV-3:F=31.37,P<0.001),初步证实过表达ENKUR后,卵巢癌体内成瘤能力减弱；6)Western blot实验显示,稳定过表达ENKUR后,PI3K、Akt、p-P13K、p-Akt、 c-Myc、CDK4和CCND1表达下调,P21表达上调。表明ENKUR可抑制周期相关蛋白,抑制细胞增殖过程。3.ENKUR在卵巢癌中抑制癌细胞的侵袭转移及其分子机制1)Transwell小室迁移实验表明,过表达ENKUR组细胞穿过聚碳酸酯膜的数量少于空白对照组(OVCAR-3:t=4.625,P=0.010；SK-OV-3:t=7.289,P=0.002)； Boyden小室侵袭实验表明过表达ENKUR组穿过聚碳酸酯膜细胞的数量少于空白对照组(OVCAR-3:t=4.818,P=0.009；SK-OV-3:t=6.601,P=0.003).同时,Transwell实验还提示,干扰组细胞穿过聚碳酸酯膜的数量明显多于空白对照组(OVCAR-3:t=6.549,P=0.003；SK-OV-3:t=4.287,P=0.013)；Boyden实验提示,干扰组细胞穿过聚碳酸酯膜的数量明显增多,对照组和干扰组差异显著(OVCAR-3:t=9.492,P=0.001；SK-OV-3:t=17.687,P<0.001)；2) Western blot实验显示,稳定过表达ENKUR后,PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt、 N-CA、Vimentin表达下调,E.CA表达上调。结论卵巢癌细胞株稳定过表达ENKUR和干扰ENKUR表达后,通过一系列的功能实验,表明细胞增殖、侵袭与转移的能力减弱,通过Western blot检测结果提示ENKUR对卵巢癌细胞周期和EMT的调控可能是通过PI3K/Akt信号通路实现,从而影响卵巢癌的发生发展过程。