所谓药物性的肝损伤主要指药物或者其代谢产物由于个体、环境等各种因素造成的肝损伤。由于临床发病症状不明显、发病不可预测、发病率较高等多种原因致死率已占据病因性死亡的第五位,成为世界范围内研究者、临床医生、制药公司、药物监管机构讨论的热门话题,同时也成为临床用药及新药研发的重大挑战。补骨脂为豆科植物补骨脂的果实,药理作用众多,受到众多临床用药者的喜爱,但是近年来越来越多的实验研究、临床报告都表明补骨脂在用药过程中能诱发肝损伤,补骨脂具有肝毒性作用证据确凿。补骨脂二氢黄酮甲醚为补骨脂乙醇提取物中的黄酮类化合物,目前发现具有治疗哮喘和心血管疾病、神经保护、抗肿瘤、抗炎、抗氧化等作用,具有较大的临床开发价值,提高其用药安全至关重要。本文利用HepG2和HepaRG细胞对补骨脂中的肝毒性成分进行筛选,并对补骨脂二氢黄酮甲醚作用于HepaRG细胞后毒性作用机制进行探讨。首先利用MTT法筛选补骨脂中的肝毒性成分,确定补骨脂二氢黄酮甲醚在HepaRG细胞中IC50值,给药剂量。利用Hoechst 33342/PI和LDH的方法检测补骨脂二氢黄酮甲醚作用于细胞24 h后诱导的细胞死亡,同时检测凋亡信号通路相关蛋白caspase-3、Bax、Bcl-2的活性,探讨细胞通过何种方式死亡。通过检测补骨脂二氢黄酮甲醚作用于细胞24 h后对细胞内ATP含量、线粒体的膜电位以及线粒体膜通道孔通透性大小和细胞色素C含量的影响,观察其对线粒体损伤的影响。通过检测补骨脂二氢黄酮甲醚作用于细胞24 h后对细胞内ROS含量及氧化系统和抗氧化系统酶活性的变化,来检测补骨脂二氢黄酮甲醚是否诱导细胞发生氧化损伤。通过检测12.5 μmol/L的补骨脂二氢黄酮甲醚作用不同时间后对细胞内ROS含量及P38和JNK蛋白活性的影响;加入P38抑制剂SB203588和抗氧化剂NAC对细胞内ROS含量及P38蛋白活性的影响;以及加入JNK抑制剂SP600125和抗氧化剂NAC后对细胞内ROS含量和JNK蛋白活性的影响,探讨ROS的产生与P38和JNK蛋白活化之间的关系。实验研究结果表明在所筛选的10种补骨脂的化学成分中毒性作用最强的为补骨脂二氢黄酮甲醚。补骨脂二氢黄酮甲醚在HepaRG细胞中的IC50值为11.97 μmol/L,24 h给药剂量为 6.25、12.5、25 μmol/L。给药 24 h 后,Bax/Bcl-2 的比值、caspase-3 蛋白的活性及LDH释放量随药物剂量增加而增加。在6.25～25 μmol/L时,其细胞凋亡率表现出显著剂量依赖性,在25 μmol/L时细胞更多的表现为坏死。补骨脂二氢黄酮甲醚给药24 h后随药物浓度的增加细胞内ATP含量、线粒体膜电位不断降低,MPTP通透性不断增加,cytC蛋白活性增强,线粒体发生损伤。补骨脂二氢黄酮甲醚给药24 h后随药物浓度的增加细胞内ROS含量不断增加,SOD、CAT、GSH酶活性逐渐降低,MDA酶活性逐渐升高,细胞发生氧化损伤。补骨脂二氢黄酮甲醚12.5 μmol/L作用于细胞不同时间后,细胞内ROS的含量逐渐增加,P38蛋白活性在1 h达到最大,随后逐渐降低,JNK蛋白活性在6 h达到最大。加入P38抑制剂SB203588在1 h时能明显抑制ROS的产生,在1 h内能明显抑制P38蛋白的磷酸化;加入抗氧化剂NAC后30 min时能明显抑制P38蛋白磷酸化和ROS的产生。加入JNK抑制剂SP600125后在6 h能明显抑制ROS的产生,在3-6 h能明显抑制JNK的磷酸化,加入抗氧化剂NAC后在3 h能明显抑制ROS的产生,不能抑制JNK蛋白磷酸化。综合上述的实验结果我们可以得出结论补骨脂中的肝毒性最强成分为补骨脂二氢黄酮甲醚。补骨脂二氢黄酮甲醚作用于HepaRG细胞后能通过损伤线粒体,诱导细胞发生氧化损伤导致细胞凋亡和坏死,其毒性作用机制早期损伤1 h内涉及ROS的产生和P38蛋白激活,二者之间相互影响,3-6 h涉及ROS的蓄积和JNK的激活,JNK对ROS产生具有促进作用。ROS以及P38、JNK蛋白的激活在不同时间发挥作用。