斑马鱼(Danio rerio)重组CD36基因的原核表达及功能研究

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CD36是一种跨膜糖蛋白,属于B族清道夫受体(class B scavenger receptor,SR-B)。研究发现,CD36在哺乳动物的很多组织和细胞中表达,参与多种生理和病理过程,如免疫调控、脂肪类食物的味觉感受、细胞粘附、血管再生和肥胖、动脉硬化和心肌病变等。但目前的研究工作主要集中在哺乳动物中,在鱼类中的研究还很薄弱。斑马鱼是重要的鱼类模式生物。最近,我们对斑马鱼CD36基因的组织分布、胚胎发育时期的时空表达模式及其在免疫中的作用作了初步研究。本文在我们前期研究的基础上,对斑马鱼CD36基因进行了原核体外表达,并对其功能进行了进一步研究。首先,我们对斑马鱼CD36基因进行了原核体外表达。利用PCR技术对斑马鱼CD36基因序列进行了克隆。其cDNA长度为1185bp,可编码395个氨基酸的蛋白质,分子量为46.8kDa。将该片段同pET-28a原核表达载体连接,构建了重组原核表达载体,转化大肠杆菌并成功进行了诱导表达。重组CD36蛋白的表达部位主要在包涵体中。其次,我们对重组CD36蛋白的免疫功能进行了研究。对重组蛋白CD36进行了溶解、纯和透析复性。抗菌活性检测发现它对革兰氏阴性细菌大肠杆菌和革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌均有抑制作用。经FITC标记的重组蛋白可以和革兰氏阴性细菌大肠杆菌和革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌均发生结合,提示重组蛋白的抑菌机理可能是通过重组蛋白同细菌结合实现的。最后,我们构建了CD36pCS2-TALEN载体,为利用TALEN技术对斑马鱼CD36基因进行敲除奠定了基础。设计了一对定向突变CD36基因该区域的靶位点序列,利用最新的“Unit Assembly”方法成功构建了一对TALEN表达载体,为斑马鱼CD36的基因敲除迈出了重要的一步,并为进一步利用突变的方法研究斑马鱼CD36功能及其机理奠定了基础。
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