多沙唑嗪(doxazosin, DOX)属长效、高选择性α1受体阻断药,是冶疗良性前列腺增生合并下尿路症状(BPH/LUTS)的一线用药,也是临床抗高血压治疗的添加药物。多沙唑嗪的化学结构中存在一个手性碳原子,目前临床使用的为其外消旋体的口服剂型。多沙唑嗪对映体在药理效应方面呈现明显的立体选择性差异,左旋多沙唑嗪静脉给药降低麻醉大鼠颈动脉血压作用明显弱于同剂量的右旋多沙唑嗪。在药代动力学方面,当人口服消旋多沙唑嗪后,右旋多沙唑嗪的AUC值显著高于左旋多沙唑嗪。当手性药物以外消旋体给药时,很有可能在药动学上出现对映体间相互作羽,影响临床疗效,但目前有关多沙唑嗪单独对映体给药后的立体选择性药动学及消旋多沙唑嗪给药后两对映体在药动学上相互作用的研究尚未见报道。本研究的目的：1)采用高效液相色谱仪及FLD荧光检测器,测定大鼠灌胃给予消旋多沙唑嗪(60 mg/kg)、左旋多沙唑嗪(3.0mg/kg)和右旋多沙唑嗪(30 mg/kg)后两对映体的血药浓度,研究多沙唑嗪两对映体的立体选择性药动学并分析对映体间的相互作用；2)进一步研究静脉注射消旋多沙唑嗪(60 mg/kg)、左旋多沙唑嗪(30 mg/kg)和右旋多沙唑嗪(30 mg/kg)后两对映体的药动学特征,综合分析两对映体在吸收、分布与消除环节上的相互作用；3)在此基础上采用大鼠肝微粒体孵育实验研究多沙唑嗪对映体在代谢上的立体选择性及相互作用,从代谢角度对多沙唑嗪对映体的立体选择性药动学进行分析。第一部分大鼠口服给予多沙唑嗪及其对映体后的手性药代动力学特征目的：研究大鼠口服给予多沙唑嗪及其对映体后的手性药代动力学特征。方法：应用手性高效液相色谱荧光检测法测定SD大鼠灌胃给予消旋多沙唑嗪(6.0 mg/kg)、左旋多沙唑嗪(3.0 mg/kg)和右旋多沙唑嗪(3.0mg/kg)舌两对映体的血药浓度,用WinNonlin 5软件提供的一级动力学血管外给药统计矩模型计算相应的药动学参数。结果：1高效液相色谱法的方法学验证采用手性高效液相色谱法测定血浆中的左旋多沙唑嗪和右旋多沙唑嗪,专属性良好,内标(哌唑嗪)、左旋多沙唑嗪和右旋多沙唑嗪达到基线分离,血浆中内源性物质不干扰多沙唑嗪对映体及内标的测定。左旋多少唑嗪和右旋多沙唑嗪的最低检测限均为4 ng/mL,在4-2000 ng/mL范围为多沙唑嗪对映体的浓度与峰面积呈良好的线性关系(r>0.9990)。多沙唑嗪对映体的日内、日间精密度分别小于15%,回收率为93.9%-104.1%。2大鼠灌胃给予消旋多沙唑嗪后两对映体血药浓度的变化大鼠灌胃给予消旋多沙唑嗪(6.0 mg/kg)后,两对映体的药时曲线均呈现双峰现象；经统计分析,除15 min外,各取血点的右旋多沙唑嗪血药浓度均显著高于左旋多沙唑嗪(P<0.05,P<0.01)。3大鼠灌胃给予多沙唑嗪单独对映体后血药浓度的变化单独给予左旋多沙唑嗪(3.0 mg/kg)或右旋多沙唑嗪(3.0 mg/kg)后,大鼠血浆中未检测到两对映体间的手性转化,并且两对映体药时曲线的双峰现象均不明显；经统计分析,各取血点的右旋多沙唑嗪血药浓度均高于左旋多沙唑嗪；两条药时曲线差异显著(P<0.01)4大鼠灌胃给予消旋多沙唑嗪后各对映体的药动学参数右旋多沙唑嗪的Cmac值显著高于左旋多沙唑嗪,其AUC值是左旋多少唑嗪的7.3倍,右旋多沙唑嗪的Vd/F和C,F值均显著低于左旋多沙唑嗪,其MRT值显著高于左旋多沙唑嗪(P<0.01,P<0.05)。5大鼠灌胃给予多沙唑嗪单独对映体后的药动学参数与消旋多沙唑嗪中的左旋多沙唑嗪相比,左旋多沙唑嗪单独给药后的Cmax值显著升高(P<0.05),由对照组的53.2 ng/mL升高至110.5ng/mL升高了108%。与消旋多沙唑嗪中的右旋多沙唑嗪相比,右旋多沙唑嗪单独给药后的λ值降低了32%(P<0.05)。小结：多沙唑嗪对映体在大鼠的体内过程存在立体选择性,无论大鼠灌胃给予消旋多沙唑嗪还是多沙唑嗪单独对映体后,右旋多沙唑嗪的Cmax直和AUC值均显著高于左旋多沙唑嗪,其Cl值均显著低于左旋多沙唑嗪；并且灌胃给予消旋多沙唑嗪后,两对映体可能存在药动学上的相互作用。第二部分 大鼠静脉注射给予多沙唑嗪及其对映体后的手性药代动力学特征目的：研究大鼠静脉注射给予多沙唑嗪及其对映体后的手性药代动力学特征。方法：应用手性高效液相色谱荧光检测法测定SD大鼠静脉注射消旋多沙唑嗪(60 mg/kg)、左旋多沙唑嗪(3.0 mg/kg)和右旋多沙唑嗪(3.0mg/kg)后两对映体的血药浓度。采用WinNonlin 5.1软件提供的一级动力学静脉注射二室模型及统计矩模型计算多沙唑嗪对映体药物动力学参数。结果：1大鼠静脉注射消旋多沙唑嗪后两对映体血药浓度的变化大鼠静脉注射消旋多沙唑嗪(6.0mg/kg)后,两对映体的药时曲线均呈双指数下降,经统计分析,除360 min外,各取血点的右旋多沙唑嗪血药浓度均显著高于左旋多沙唑嗪(P<0.01)。2大鼠静脉注射多沙唑嗪单独对映体后血药浓度的变化大鼠静脉注射单独对映体左旋多沙唑嗪(3.0 mg/kg)和右旋多沙唑嗪(3.0 mg/kg)后,大鼠血浆中同样未检测到两对映体间的手性转化。经统计分析,除360 min时间点外,各取血点的右旋多沙唑嗪血药浓度均高于三旋多沙唑嗪(P<0.05,P<0.01)。大鼠静脉注射左旋多沙唑嗪后,与消旋多沙唑嗪中的左旋多沙唑嗪相比,左旋多沙唑嗪的血浆浓度值无显著变化(P>0.05)。大鼠静脉注射右旋多沙唑嗪后,与消旋多沙唑嗪中的右旋多沙唑嗪相比,右旋多沙唑嗪的血浆浓度值普遍降低,并且在5min、10min、15min和30min时间点有显著性差异(P<0.05,P<0.01)。3大鼠静脉注射消旋多沙唑嗪后各对映体的药动学参数采用二室模型法计算两对映体的主要药动学参数,右旋多沙唑嗪的Cmax值显著高于左旋多沙唑嗪,其AUC值是左旋多沙唑嗪AUC值的3.2倍,其稳态表观分布容积(Vss)值显著小于左旋多沙唑嗪(P<0.01)。此外,左旋多沙唑嗪的消除速率常数(K10)和Cl值均显著大于右旋多沙唑嗪(P<0.01)。采用非房室模型法计算所得药动学参数与二室模型法计算的药动学参数相似。4大鼠静脉注射多沙唑嗪单独对映体后的药动学参数大鼠静脉注射左旋多沙唑嗪后,与消旋多沙唑嗪中的左旋多沙唑嗪相比,左旋多沙唑嗪时的AUC值、Gmax值和Cl值均无显著变化(P>0.05)。大鼠静脉注射右旋多沙唑嗪后,与消旋多沙唑嗪中的右旋多沙唑嗪相比时,其AUC值降低了14%,Cmax值降低了17%,而Cl值增大了17%(P<.01,P<0.05)。小结：多沙唑嗪对映体在大鼠的体内过程存在明显的立体选择性,并且灌胃给予消旋多沙唑嗪后两对映体在药动学上立体选择性程度更高。另外,消旋多沙唑嗪进入体循环后,其右旋多沙唑嗪基本不干扰左旋多沙唑嗪在体内的代谢和排泄过程；而左旋多沙唑嗪对右旋多沙唑嗪的代谢与排世可能具有抑制作用。这说明口服消旋多沙唑嗪后右旋多沙唑嗪血药浓度显著高于左旋多沙唑嗪,其原因除了左旋多沙唑嗪和右旋多沙唑嗪在药动学方面所具有明显的立体选择性之外,左旋多沙唑嗪尚可通过抑制右旋多少唑嗪的代谢与排泄过程而进一步增加了右旋多沙唑嗪的暴露。并且两个对映体的胃肠吸收也可能存在相互抑制。第三部分 在大鼠肝微粒体中多沙唑嗪代谢的立体选择性及对映体间的相互作用目的：研究在大鼠肝微粒体中多沙唑嗪代谢的立体选择性及对映体间的相互作用。方法：差速离心法制备大鼠肝微粒体,BCA蛋白质定量法测定蛋白农度,Omura和Sato方法测定CYP450酶含量。优化大鼠肝微粒体中温孵反应的条件。采用测定底物消除速率常数(kdep)的方法研究1)多沙唑嗪对映体在代谢中的立体选择性；2)多沙唑嗪每个对映体在代谢过程中涉及的P450酶；3)左旋多沙唑嗪和右旋多沙唑嗪在代谢上的相互作用。结果：1高效液相色谱法的方法学验证用于肝微粒体中的多沙唑嗪对映体测量的手性高效液相色谱法具有良好的选择性,哌唑嗪(内标)、左旋多沙唑嗪和右旋多沙唑嗪的色谱峰均达到基线分离,并且内源性物质、多沙唑嗪的代谢物均无干扰。在0.25～2.5 μg/mL浓度范围,两对映体线性关系良好。左旋多沙唑嗪回收率为93.7～112.0%,日内、日间精密度分别小于2.1%、10.1%；右旋多沙唑嗪回收率为91.0～114.6%,日内、日间精密度分别小于2.4%、6.9%。该分析方法选择性强、准确度高、重现性好,适于多沙唑嗪对映体在大鼠肝微粒体中的测定研究。用于肝微粒体中的多沙唑嗪测量的非手性高效液相色谱法具有良好的选择性,哌唑嗪(内标)和多沙唑嗪的色谱峰均达到基线分离,并且大鼠肝微粒体孵育液中多沙唑嗪及哌唑嗪的测定没有受到内源性物质、代谢产物及其他物质的干扰。为了测定多沙唑嗪在大鼠肝微粒体中浓度,在0.25～12.5μg/mL浓度范围内进行回归计算求得各自的标准方程。低、中和高浓度质控样品的日内和日间精密度均小于10%,准确度在±5%的范围内,该分析方法选择性强、准确度高、重现性好,能满足大鼠微粒体孵育液中左旋多沙唑嗪或右旋多沙唑嗪定量检测的需要。2多沙唑嗪对映体在大鼠肝微粒体中NADPH依赖性研究在不加NADPH再生系统溶液的对照组中,消旋多沙唑嗪(10 μg/mL)两对映体均不发生代谢转化。加入NADPH再生系统溶液时,消旋多沙唑嗪两对映体发生显著的代谢消除,左旋多沙唑嗪和右旋多沙唑嗪的Kdep值(1/min)分别为0.0125±0.00061/min和0.0113±0.00061/min.表明多沙唑嗪的代谢是NADPH依赖性的。3大鼠肝微粒体中多沙唑嗪对映体代谢的Km值测定左旋多沙唑嗪和右旋多沙唑嗪在大鼠肝微粒体代谢的酶动力学参数Km值分别是3.505±0.922μg/mL和3.296±0.723 μg/mL4大鼠肝微粒体中多沙唑嗪对映体的立体选择性代谢将大鼠肝微粒体与消旋多沙唑嗪(6.0 μg/mL)一起孵育时,其中左旋多沙唑嗪Kdep值(0.0107±0.00071/min)显著高于右旋多沙唑嗪(0.0088±0.0005 1/min,P<0.05),提示左旋多沙唑嗪比右旋多沙唑嗪消除更快。但将大鼠肝微粒体与左旋多沙唑嗪(3.0 μg/mL)或右旋多沙唑嗪(3.0 μg/mL)一起孵育时,左旋多沙唑嗪的Kdep值(0.0097±0.0007 1/min)显著低于右旋多沙唑嗪(0.0113±0.0003 1/min,P<0.05),提示右旋多沙唑嗪比左旋多沙唑嗪消除更快。5大鼠肝微粒体中多沙唑嗪对映体代谢的CYP亚型研究了5种CYP酶化学特异性抑制剂α-萘黄酮、奎尼丁、酮康唑、磺胺甲恶唑、4-甲基吡唑对多沙唑嗪对映体代谢作用的影响,其中酮康唑在大鼠肝微粒体中对左旋多沙唑嗪和右旋多沙唑嗪的消除显示出最大抑制作用。酮康唑的抑制作用随着浓度增大而增加,并且在20 μmol/mL寸抑制活性几乎100%。当酮康唑浓度在1.0μmol/mL2.0μmol/mL时,旋多沙唑嗪和右旋多沙唑嗪的消除速率常数分别显著低于对照组(P<0.01)。另外,加入4-甲基吡唑后,左旋多沙唑嗪的消除显著减少。当4-甲基吡唑的浓度从0增至10μmol/mL时,左旋多沙唑嗪的Kdep值从1.00548±0.00013 1/min降至0.00453±0.00012 1/min,显著低于对照组。旦右旋多沙唑嗪的消除不受4-甲基吡唑影响。而对于α-萘黄酮、奎尼丁和磺胺甲恶唑,没有观察到在所研究浓度范围内对左旋多沙唑嗪或右旋多少唑嗪有抑制作用。6多沙唑嗪对映体代谢的相互作用单独将左旋多沙唑嗪或右旋多沙唑嗪(3.0μg/mL)与大鼠微粒体孵育时,多沙唑嗪两对映体的Kdep值未见统计学差异(P>0.05)。当孵育体系中含等浓度多沙唑嗪两对映体(15μg/mL(-)DOX,1.5μg/mL(+)DOX)时,右旋多沙唑嗪的Kdep值低于左旋多沙唑嗪(P<0.05),这与消旋多沙唑嗪孵育时结果一致。并且在(10μg/mL(+)DOX:2.0μg/mL(-)DOX)和(0.5μg/mL(+)DOX:2.5μg/mL(-)DOX)的混合物中右旋多沙唑嗪的Kdep直显著低于在(1.0μg/mL(-)DOX:2.0μg/mL(+)DOX)和(0.5μg/mL(-)DOX：2.5 μg/mL(+)DOX)的混合物中左旋多沙唑嗪的Kdep值(P<0.05)。小结：当消旋多沙唑嗪与大鼠肝微粒体一起孵育时,左旋多沙唑嗪的俏除显著快于右旋多沙唑嗪,但多沙唑嗪单独对映体分别与大鼠肝微粒体一起孵育时,左旋多沙唑嗪的消除并不比右旋多沙唑嗪快。左旋多沙唑嗪l的代谢经CYP3A和CYP2E催化,但右旋多沙唑嗪的代谢只被CYP3A催化。当多沙唑嗪两个对映体按不同比例混合后孵育,左旋多沙唑嗪消除总是比右旋多沙唑嗪快。从这些结果可初步确定,正是因为多沙唑嗪两对映体的代谢均由CYP3A催化,导致左旋多沙唑嗪对右旋多沙唑嗪的代谢产了抑制作用。结论：多沙唑嗪对映体在大鼠的药物动力学存在立体选择性,右旋多沙唑嗪的Cmax值和AUC值均显著高于左旋多沙唑嗪。当多沙唑嗪以消旋体形式给药时,两对映体在药动学上存在相互作用。右旋多沙唑嗪基本不干扰左旋多沙唑嗪在体内的代谢和排泄过程；而左旋多沙唑嗪对右旋多沙唑嗪的代谢与排泄可能具有抑制作用。并且两个对映体的胃肠吸收也可能存在相互抑制。多沙唑嗪对映体在大鼠肝微粒体代谢中存在立体选择性,当消旋多沙唑嗪与大鼠肝微粒体一起孵育时,左旋多沙唑嗪的消除显著快于右旋多沙唑嗪。左旋多沙唑嗪的代谢经CYP3A和CYP2E催化,但右旋多沙唑嗪的代谢只被CYP3A催化。由于多沙唑嗪两对映体均被CYP3A催化,当多沙唑嗪两个对映体混合后与大鼠肝微粒体一起孵育时,存在代谢上的相互作用,左旋多沙唑嗪对右旋多沙唑嗪的代谢产生了更强的抑制作用。