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种子的休眠和萌发是植物生命周期中两个重要的阶段,同时也是影响作物生产的农艺性状。有研究表明,除了通过ABA和GA在种子中的平衡调控休眠和萌发之外,生长素也发挥了调控功能。miR393是植物中最为保守的miRNA家族之一,在拟南芥中其靶基因编码生长素受体F-box蛋白TIR1/AFB家族(theTIR1/AFB Auxin Receptor, TAAR)。我们的前期数据显示,miR393表达受到ABA调控,其靶基因调控种子萌发对ABA的敏感性,但miR393是否参与影响种子成熟和萌发及相关机制目前仍知之甚少。本研究以拟南芥miR393及其靶基因的各种报告株系及突变体为材料,探究miR393如何通过靶基因TIR1及相关激素信号途径参与调控拟南芥种子的成熟和萌发,获得了以下主要结果：1拟南芥种子成熟和萌发过程miR393及其靶基因的表达模式1.1种子成熟和萌发过程miR393及其靶基因的组织特异性表达模式采用MR393a/b启动子报告株系pMIR393a/b:GUS,突变型和野生型靶蛋白报告株系pTIR1:mTIR1-GUS,pTIR1:cTIR1-GUS和生长素反应报告株系DR5:GUS,对拟南芥不同时期荚果和吸胀的种子进行GUS染色。结果显示,MIR393b在种子成熟中期(Stage Ⅲ)转录增强,在后期Stage Ⅳ表达减弱；MIR393a的转录在所检测的几个时期变化不显著。cTIR1蛋白的表达在Stage Ⅰ至stage Ⅲ受到明显的转录后抑制,而DR5表示的生长素反应信号在成熟早期(Stage Ⅰ—Stage Ⅲ)较强,至成熟后期GUS信号减弱。在种子吸胀过程中,miR393的表达有上升趋势,pMIR393a的转录集中在子叶和胚根,pMIR393b则主要在子叶中转录,miR393的积累与DR5:GUS表达的位点相互重合；CTIR1在干种子和吸胀种子中均有表达,随萌发进行有增强的趋势,表达位点包括子叶近轴端和胚根延长区,根尖无表达；而不受miR393调控的突变版本mTIR1蛋白表达范围更广,GUS阳性部位扩散至根尖,说明TIR1蛋白的积累受到miR393的抑制：TIR1蛋白积累的位点与DR5:GUS表达的位点在子叶中重合,在胚根中相斥。这些数据暗示miR393介导的转录后调控,对于种子成熟和萌发过程TIR1的空间分布及生长素反应有一定的调控作用。1.2在种子成熟和萌发过程中miR393及其靶基因表达水平的变化用野生型Co1.0作为材料,对种子成熟和萌发过程中的miR393及其靶基因进行定量RT-PCR检测。结果显示,在种子成熟过程中,miR393前体pri-MIR393b的表达水平先升后降,靶基因TIR1, AFB2和AFB3表达呈下调趋势,说明在种子成熟后期,miR393及其靶基因逐步关闭功能；在种子吸胀过程中,随着种子开始萌发,miR393及其靶基因的表达均明显上调。说明在种子成熟和萌发过程中,miR393的丰度与生长素反应密切相关,其靶基因转录本的水平受到多种因素的影响。2 拟南莽miR393通过与ABA途径互作调控种子休眠2.1 ABA处理影响miR393表达用5 μM ABA处理拟南芥Co1.0种子1天,定量RT-PCR的结果显示：ABA处理后,miR393和靶基因的表达均下调,说明ABA负调控miR393的表达。2.2 miR393影响种子的初生休眠以拟南芥野生型CoLO, miR393功能缺失突变体mir393ab,靶基因过量表达转基因纯合株系35S:mTIR1, miR393功能抑制株系35S.MIM393作为实验材料,统计将刚收获种子的萌发率和出绿率。结果发现：与野生型相比,35S:mTIR1和35S.MIM393株系的萌发率显著低于野生型。这说明miR393可能通过TIR1负调控种子的初生休眠。2.3 miR393影响种子萌发和幼苗生长对ABA的敏感性在含有不同浓度ABA的培养基中萌发种子,统计萌发率、出绿率和根伸长对ABA的敏感性。结果显示,与野生型相比,3个突变体株系mir393ab, 35S:mTIR1和35S.MIM393的萌发率和出绿率均有显著降低,而35S:mTIR1根伸长显著降低,从而说明miR393负调控种子萌发和幼苗生长对ABA的敏感性。2.4 miR393对种子成熟和萌发过程生长素和ABA信号相关基因表达的影响以拟南芥拟南芥野生型CoLO,35S:MIR393a,mir393ab,35S:mTIR1为材料,对种子成熟和萌发过程,生长素和ABA信号相关的基因表达进行了qRT-PCR检测。对生长素信号相关基因ARF1O的qRT-PCR检测显示：在种子成熟过程中,ARF10转录本水平呈先升后降的趋势,在35S:mTIR1株系中ARF1O在Stage Ⅲ显著增加,说明TIR1水平的提高,促进这一时期ARF10的表达。在萌发期,ARF10转录本水平逐渐上升,在35S:mTIRl和mir393ab株系的干种子(DS)中,ARF10的转录水平显著低于野生型,但在萌发过程中,ARF1O表达水平显著上升,上调幅度较大。对ABA信号通路相关基因的qRT-PCR检测显示：在成熟中后期mir393ab突变体中ABI3和ABI4水平显著高于野生型,在吸胀萌发后期(DAC1) 35S:mTIR1突变体中ABI3和ABI4显著高于野生型,暗示miR393可能通过TIR1调控种子成熟和萌发期ABI3和ABl4的表达水平。总之,在种子成熟和萌发过程中,miR393通过自身的特异表达,抑制其靶基因TIR1的水平及空间分布,负调控种子的初生休眠及种子萌发和幼苗生长对ABA的敏感性。这些结果为发现miR393的新功能,以及阐明种子休眠和萌发过程的激素信号途径和分子调控机制调控提供了新的数据。