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研究背景手足口病（Hand,foot,and mouth disease,HFMD）是一种肠道病毒感染所引起的常见儿童传染性疾病,在世界范围内曾多次出现大规模暴发流行,严重危害儿童生命健康的安全。肠道病毒71型（Enterovirus A71,EV-A71）和柯萨奇病毒A组（Coxsackievirus A,CVA）16型被认为是导致HFMD的主要病原体。然而,近些年来以CVA6和CVA10为代表的非EV-A71和非CVA16肠道病毒所引起的HFMD的报道越来越多,甚至已取代EV-A71和CVA16成为导致HFMD暴发的优势株,表明HFMD的病原学图谱正发生着剧烈的变化。广州作为HFMD的高发城市之一,近些年对其病原学调查研究的相关研究报道尚不全面,因此急需对广州地区HFMD病原学流行情况进行全面且详尽的监测。另一方面由于由CVA6所引起的HFMD的暴发越来越常见,同时,CVA6感染所导致的非典型HFMD临床表现给临床诊断也带来了挑战,使实际感染人数被低估及延误对疾病的诊疗。尽管EV-A71疫苗已被成功研制并得到运用,但它不能对CVA6感染产生交叉免疫保护,目前对于HFMD治疗并无特效药可用,早诊断早治疗是提高患儿临床预后和阻断疾病传播的重要手段。因此,本研究通过对2018年广州地区HFMD流行情况进行调查研究,阐明广州地区HFMD的流行病学特征和病原学构成情况,为HFMD的防治策略提供科学依据;同时基于逆转录重组酶聚合酶扩增技术（Reverse-transcription recombinase polymerase amplification,RTRPA）与侧流层析试纸条法（Lateral flow strip,LFS）建立一种简单、快速且准确的CVA6检测方法,对HFMD诊断和防控具有重要意义。方法1.2018年广州地区HFMD流行病学调查为了解2018年广州地区HFMD流行情况,收集并分析2018年在广东省妇幼保健院收治经临床诊断为HFMD的1220例患儿的临床资料和实验室检查结果,采用逆转录实时荧光定量PCR（Real-time quantitative RT-PCR,q RT-PCR）和逆转录半巢氏PCR（Reverse transcription semi-nested PCR,RT-sn PCR）与测序结合的方法对所收集的肠道病毒临床标本进行分型鉴定,随后选取2018年广州地区HFMD的3种主要流行的病原体（CVA6、CVA10和CVA16）的VP1基因全长序列进行了遗传进化分析,分析其分子流行病学特征。2.CVA6快速检测方法的建立针对CVA6的VP1基因序列设计RPA特异性引物及探针,建立并优化CVA6的RT-RPA-LFS检测方法。制备CVA6 RNA标准品并进行连续倍比稀释,用q RT-PCR方法进行平行检测,以比较该方法的灵敏度。选用一系列非CVA6型肠道病毒（CVA2、CVA4、CVA5、CVA9、CVA10、CVA16、EV-A71、CVB2、CVB3、Echovirus3、Echovirus11、Echovirus18）对RT-RPA-LFS检测方法的特异性进行评价。收集142份经商品化肠道病毒通用型核酸检测试剂盒检测确认的肠道病毒阳性临床样本,用RT-RPA-LFS、q RT-PCR和RT-sn PCR方法对样本进行平行检测,以评价RT-RPA-LFS检测方法的临床检测性能。结果1.2018年广州地区HFMD流行病学调查通过对2018年广州地区所收集的1220例HFMD患儿的临床样本进行肠道病毒病原学图谱分析,此次共检出21种肠道病毒血清型,其中CVA6（364/1220,29.8%）、CVA10（305/1220,25.0%）和CVA16（397/1220,32.5%）是导致HFMD的三种主要病原体,占总检出率的87.3%。对肠道病毒流行季节进行调查分析发现,CVA6是导致HFMD秋季流行的优势病原体,而CVA10和CVA16夏季流行的优势病原体。CVA6、CVA10和CVA16三种病原体感染的患儿临床表现及实验室检查结果相似,三者重度HFMD的发生率分别为5.8%、5.9%和1.5%。遗传进化分析结果显示,2018年广州地区所流行的CVA6、CVA10和CVA16流行株分别属于E2、E和B1基因型。2.CVA6快速检测方法的建立本研究建立了一种简便、快速且准确的CVA6一步法RT-RPA-LFS检测方法,该方法可37℃条件下35min内完成对CVA6的检测,无需昂贵的仪器设备,用肉眼即可对结果进行判读。RT-RPA-LFS检测方法的灵敏度为10拷贝/反应,与传统的q RT-PCR检测方法无差异。在特异性实验中,只有CVA6阳性样本实验结果为阳性,其他非CVA6病原体检测结果均为阴性,RT-RPA-LFS检测方法的特异性为100%。对142例临床标本检测结果显示,RT-RPA-LFS、q RT-PCR和RT-sn PCR检测方法的结果符合率为100%。结论2018年广州地区HFMD呈现CVA6、CVA10和CVA16三种病原体共同流行的特点,且其在流行时间上呈现季节性分布,CVA6是导致HFMD秋季流行的优势病原体,而CVA10和CVA16夏季流行的优势病原体;本研究同时建立了一种简便、快速且准确的CVA6一步法RT-RPA-LFS检测方法,进一步完善了HFMD的检测方法,为HFMD的防控提供有效的措施。