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一、Neuro D-EGFP融合蛋白的表达、纯化及跨膜转导作用的研究【目的】构建神经源性分化因子Neuro D与绿色荧光蛋白EGFP的融合蛋白,并研究其跨膜转导作用。【方法】构建Neuro D-EGFP原核表达载体,利用宿主大肠杆菌BL21(DE3)表达重组NeuroD-EGFP融合蛋白,再利用层析柱纯化得到重组Neuro D-EGFP融合蛋白。利用荧光显微镜等观察Neuro D-EGFP融合蛋白的跨膜转导能力。【结果】成功构建了Neuro D-EGFP原核表达载体,应用原核表达系统成功表达和纯化融合蛋白,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表明得到了Neuro D-EGFP融合蛋白。在IEC-6及RKO细胞上清中加入Neuro D-EGFP融合蛋白后,观察发现Neuro D-EGFP融合蛋白发出的绿色荧光聚集在细胞内部。对小鼠进行腹腔注射Neuro D-EGFP融合蛋白,5小时后在荧光显微镜下发现绿色荧光聚集在小鼠肠道上皮细胞内。【结论】成功表达并纯化得到了重组的Neuro D-EGFP融合蛋白,并验证了其跨膜转导能力。二、Neuro D-EGFP融合蛋白对小鼠放射性肠损伤的治疗作用【目的】探讨Neuro D-EGFP融合蛋白对小鼠放射性肠损伤的治疗作用。【方法】C57小鼠分两批次,每批次随机分为PBS组、EGFP组、Neuro D-EGFP组,两批次分别给予8Gy、9Gyγ线全身照射,观察并记录小鼠的体重变化及生存情况,绘制生存曲线。取9Gyγ线全身照射三组小鼠的肠组织,制备病理切片,应用H&E染色观察Neuro D-EGFP融合蛋白对辐射后小鼠肠道病理形态学的影响,应用TUNEL染色观察其对辐射后小鼠肠道隐窝凋亡细胞数目的影响,应用Ki-67染色观察其对小鼠肠道隐窝增殖细胞数目的影响,探讨Neuro D-EGFP融合蛋白对辐射后肠道组织的治疗作用。【结果】与PBS组及EGFP组相比,Neuro D-EGFP融合蛋白改善了8Gyγ线照射后小鼠的体重并提高了生存率。对9Gyγ线全身照射后的小鼠肠道组织进行分析,发现与PBS组和EGFP组相比,Neuro D-EGFP组小鼠肠道绒毛高度、隐窝深度及隐窝数目均大于其他两组(F=49.49,16.72,10.32,P<0.01),同时肠道隐窝凋亡细胞数目较其他两组少(F=42.39,P<0.01),肠道隐窝Ki-67(+)细胞数目较多(F=33.21,P<0.01)。【结论】Neuro D-EGFP融合蛋白促进了辐射后肠道绒毛及隐窝的修复,减少了辐射引起的肠道隐窝细胞凋亡并促进了其增殖,对放射性肠损伤具有治疗作用。三、Neuro D-EGFP融合蛋白对小鼠放射性肠损伤治疗作用的机制研究【目的】探索Neuro D-EGFP融合蛋白对小鼠放射性肠损伤治疗作用的机制。【方法】取9Gy照射后12h EGFP和Neuro D-EGFP处理小鼠的肠组织,应用基因表达谱芯片筛选两种处理小鼠肠组织的差异表达基因,应用qRT-PCR对差异表达基因Enpp7、Mbl2、Slc13a1和Slc40a1进行了验证。通过筛选Neuro D靶向基因,应用免疫组化的方法探索Neuro D-EGFP融合蛋白对辐射后小鼠肠道组织中组织基质金属蛋白酶抑制剂-1(Timp-1)表达的影响。【结果】小鼠肠道组织基因芯片表明Neuro D可影响多种基因的表达及信号通路。使用qRT-PCR验证了差异表达的基因。GO及KEGG富集分析显示Neuro D差异表达基因参与多个生物过程和信号通路。Neuro D可以增加辐射后小鼠肠道组织中具有抗凋亡作用的Timp-1的表达,初步阐明NeuroD对放射性肠损伤治疗作用的分子机制。【结论】Neuro D治疗放射性肠损伤的机制可能是通过诱导Timp-1的高表达,进而减轻了辐射后小鼠肠道隐窝的凋亡,促进辐射后小鼠肠道组织的修复。